[發(fā)明專利]程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510854698.8
• 申請(qǐng)日: 2015-11-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105475133A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-04-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 林順權(quán);劉義存
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): A01H4/00
• 分類號(hào): A01H4/00
• 代理公司: 廣州粵高專利商標(biāo)代理有限公司 44102
• 代理人: 任重

1.一種程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1.程序降溫前材料預(yù)處理：將枇杷屬植物莖尖置于預(yù)培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2～4d；

S2.將預(yù)培養(yǎng)后的莖尖轉(zhuǎn)入冷凍保護(hù)劑（PVS）中，在0℃～4℃下裝載6～10h；

S3.按照程序進(jìn)行降溫處理后迅速轉(zhuǎn)入液氮保存；

S4.將在液氮中保存的材料解凍復(fù)溫；

S5.材料清洗：將解凍復(fù)溫完成的材料，用卸載液和無(wú)菌去離子水分別清洗；所述

S6.植株再生培養(yǎng)；

其中，步驟S1所述預(yù)培養(yǎng)基組成為：MS+BA（6芐基腺嘌呤）1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖0.1mol·L^-1+DMSO（二甲基亞砜）5%；

步驟S2所述冷凍保護(hù)劑的組成為：MS溶液+0.4mol·L^-1蔗糖+甘油2mol·L^-1；

步驟S3所述降溫的程序?yàn)槌跏紲囟葹?℃，從4℃降至0℃，從0℃降至-7℃，-7℃進(jìn)行溫度平衡，從-7℃降至-20℃，從-20℃降至結(jié)束溫度-40℃，在結(jié)束溫度進(jìn)行溫度平衡；

步驟S6所述植物再生培養(yǎng)的培養(yǎng)基配方為：MS+TDZ（噻苯隆）0.1mg·L-1+6-BA（6芐基腺嘌呤）1.0mg·L-1+NAA（萘乙酸）0.1mg·L-1+蔗糖30g+瓊脂粉5g；

步驟S6所述植物再生培養(yǎng)的培養(yǎng)條件：置于溫度20±1℃，濕度65%～70%條件下，24h全黑暗培養(yǎng)后再轉(zhuǎn)為24h/d光照下培養(yǎng)。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S1所述枇杷屬植物莖尖為栽培枇杷、野生枇杷或枇杷種間雜交后代的組培苗的莖尖。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S1所述枇杷屬植物莖尖長(zhǎng)0.5cm。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S3所述降溫的程序中的降溫速率為：在0℃之前降溫速率-0.3℃/min，從0℃降至-7℃降溫速率-0.1℃/min，并在-7℃停留10min進(jìn)行溫度平衡，從-7℃降至-20℃降溫速率仍然為-0.1℃/min，從-20℃降至結(jié)束溫度-40℃的降溫速率轉(zhuǎn)為-0.5℃/min，在結(jié)束溫度保持5min進(jìn)行溫度平衡，然后迅速轉(zhuǎn)入液氮保存。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S3液氮保持2小時(shí)以上。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S3液氮保持2小時(shí)～72小時(shí)。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S4所述是將在液氮中保存的材料迅速置于36℃～40℃的水浴中解凍復(fù)溫3～6min。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S5所述卸載液的組成為MS+6-BA1.0mg·L^-1+NAA0.1mg·L^-1+蔗糖30g·L^-1。

9.根據(jù)權(quán)利要求1所述程序降溫法和玻璃化法相結(jié)合超低溫保存枇杷屬植物種質(zhì)的方法，其特征在于，步驟S6所述植物再生培養(yǎng)中，光照條件為24h全黑暗的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)20d；24h/d光照條件下培養(yǎng)50d。

10.權(quán)利要求1至9任一項(xiàng)所述方法的應(yīng)用，其特征在于，應(yīng)用于栽培枇杷、野生枇杷或枇杷種間雜交后代的超低溫保存植物種質(zhì)方面。