[發明專利]一種預測大腸癌細胞對p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法

在審

• 申請號: 201510854669.1
• 申請日: 2015-11-28
• 公開（公告）號: CN105467119A
• 公開（公告）日: 2016-04-06
• 發明（設計）人: 張燕捷;秦曉雨;王欣欣;劉峰;姜斌
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院
• 主分類號: G01N33/574
• 分類號: G01N33/574
• 代理公司: 上海申新律師事務所 31272
• 代理人: 竺路玲

技術領域

本發明涉及一種細胞對特定藥物的敏感性測定方法，尤其涉及一種預測大腸 癌細胞對p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法。

背景技術

隨著人們生活水平的提高和飲食結構的變化，大腸癌在我國的發病率呈增高 趨勢，由于大腸癌發生發展的機制尚不明確，故缺乏有效的防治靶點及手段。尤 其是中晚期大腸癌，其治療手段只能以化療為主，療效以及患者預后均較差。靶 向治療是在細胞分子水平上，針對已經明確的致癌位點(腫瘤細胞內的蛋白分子 或基因片段)設計相應的治療藥物，藥物進入體內會特異地結合致癌位點，使腫 瘤細胞特異性死亡，而不波及正常組織細胞，代表了腫瘤治療的新方向。

p38MAPK(p38絲裂原活化蛋白激酶)磷酸化包括轉錄因子和激酶在內的 大量底物(MK2，HSP27等)，在細胞的轉錄、蛋白合成、信號轉導和細胞表面 受體表達等方面發揮重要作用，被作為腫瘤靶向治療的靶點而廣為研究，部分 p38MAPK激酶抑制劑(p38in)已進入早期臨床試驗。臨床前研究表明：在大腸 癌的治療中，p38in可提高部分大腸癌對5-氟尿嘧啶的敏感性、降低伊立替康的 耐藥。但是，也存在部分腫瘤對p38in耐藥。

腫瘤的發生是多因素、多步驟的，加之細胞的異質性、細胞信號通路的復雜 性和高概率的基因突變，現有技術并不能達到精準治療的目的。因此，找到一種 預測大腸癌對p38in敏感性的方法顯得尤為重要。目前尚未見文獻報道有方法可 預測大腸癌對p38in的敏感性。

PP2A是廣泛存在真核生物體內的絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶，是由催化亞基 C亞基(PP2AC)、結構亞基A亞基(PP2AA)和調節亞基B亞基(PP2AB)組 成的異三聚體。PP2AC物種間具有高度的保守性，通過可逆磷酸化使已磷酸化 激活的蛋白質脫磷酸化，參與體內眾多生物學事件。

發明內容

本發明為解決現有技術中的上述問題提出的一種預測大腸癌細胞對 p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法，有效地填補了預測大腸癌細胞對p38in的 敏感性手段的技術空白。

申請人通過大量的研究和實驗意外地發現，PP2AC通過參與調控 P38/ERK/TSC2/mTOR信號通路活性，決定大腸癌對p38in的敏感性；PP2AC低 表達的大腸癌細胞對p38in敏感，PP2AC高表達的大腸癌細胞對p38in耐藥。應 用免疫組化聯合免疫熒光技術(IHC/IF)或者單獨地檢測大腸癌組織的PP2AC 表達水平，可預測大腸癌對p38in敏感或耐藥。

為了解決上述技術問題，本發明所采取的技術措施為：

一種預測大腸癌細胞對p38MAPK激酶抑制劑敏感性的方法，包括應用免疫 組化或免疫熒光技術檢測大腸癌細胞的PP2AC表達水平，并測算H-score的步 驟；其中，若H-score數值小于100，則判定大腸癌細胞對p38MAPK激酶抑制 劑敏感，若H-score數值大于200，則判定大腸癌細胞對p38MAPK激酶抑制劑 耐藥。

為了優化上述技術方案，本發明所采取的技術措施還包括：

優選地，免疫組化操作具體為：

步驟一，切片脫蠟至水：

二甲苯Ⅰ、Ⅱ脫蠟5-10min，充分脫去石蠟；梯度酒精脫二甲苯：水洗，然 后將片子插到抗原修復盒內，用蒸餾水洗2遍；

步驟二，滅活內源性過氧化物酶：

將步驟一所得切片加入3％過氧化氫使液面覆蓋組織10min，用蒸餾水洗2 次，每次3min；

步驟三，抗原修復：

將步驟二所得切片置于檸檬酸緩沖液中微波加熱修復，待自然冷卻至室溫后 先用蒸餾水洗2次，再用PBS洗3次，每次5min；

步驟四，用非免疫血清封閉，孵育：

將步驟三所得切片用吸水紙將組織周圍的水分盡量吸盡，用免疫組化筆在組 織周圍畫一個圈，然后加入血清覆蓋組織，放入濕盒室溫孵育10-30min，濕盒 底部加入少量的水；

步驟五，一抗孵育：

棄去血清，滴加一抗4℃過夜孵育，第二天復溫45min后，用PBS將切片洗 3次，每次5min；

步驟六，二抗孵育：

滴加二抗室溫孵育30min，PBS洗3次每次5min；

步驟七，顯色反應：

加DAB顯色5－10min，浸入純水終止顯色；

步驟八，復染：