[發明專利]一種利用短鏈引物阻遏提高DNA克隆及組裝效率的方法

有效

• 申請號: 201510849165.0
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN106811459B
• 公開（公告）日: 2019-09-27
• 發明（設計）人: 戴俊彪;林繼偉;秦怡然;吳慶余;何江海洋
• 申請（專利權）人: 清華大學;無錫青蘭生物科技有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/63;C12N15/11
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;白艷

本發明公開了一種利用短鏈引物阻遏提高DNA克隆及組裝效率的方法。本發明的方法是在原載體上設計兩段DNA序列，將目標DNA片段與載體骨架序列隔開，兩段DNA序列兩側分別設計有限制性內切酶位點，在進行DNA片段組裝時，通過酶切，原載體會分為四部分，隨后加入短鏈引物，短鏈引物會與原載體上添加的DNA序列中的一條鏈互補配對，經過該阻遏過程后，由于目的DNA片段的粘性末端與載體不匹配，被切下的目的DNA片段無法被連回原載體，有效的防止了酶切的DNA片段與原載體的自連的過程，因此提高了組裝的效率。本發明的方法可以有效的減少克隆步驟、提高克隆效率以及DNA片段的組裝效率等。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種利用短鏈引物阻遏提高DNA克隆及組裝效率的方法。

背景技術

隨著全基因組測序技術的普及以及DNA合成技術的發展，合成生物學得到飛速的發展。在合成生物學的很多研究領域，科學家們都需要合成大片段的DNA，而其中釀酒酵母基因組合成項目，甚至需要將DNA片段組裝成染色體。因此探索DNA大片段的快速組裝方法是當今的研究熱點。

在過去的幾十年中，酶切-連接是最常用的克隆方法。這種DNA重組技術始于限制性內切酶和DNA連接酶的發現，隨后，多種多樣的通過使用限制性內切酶和PCR等技術的連接DNA分子的方法被不斷發展起來。然而，依賴于這些傳統技術，待克隆或者拼接的序列本身需要存在限制性內切酶識別序列或者通過引入限制性內切酶識別序列來實現。這樣不僅僅會增加操作的難度與限制，而且由于限制性內切酶識別序列的存在，會在新的序列中留下“疤痕”。因此，高效與高通量的克隆以及合成DNA的方法是當今合成生物學研究中的迫切需求。

不受序列限制的克隆的方法中包括不依賴于連接的克隆(LIC)、同時不依賴于序列和連接的克隆(SLIC)和Gibson assembly等。在近些年開發的DNA組裝技術中，很多是利用DNA重組技術，比如利用酵母體內的同源重組系統進行DNA的體內組裝。而Gibsonassembly是一個非常經典利用體外重組的方法，該方法基于5’外切酶、DNA聚合酶以及DNA連接酶，可以將多個有重疊序列的DNA片段在一個等溫反應中進行組裝。

Golden gate shuffling則是一種基于IIs型限制性內切酶的快速DNA組裝技術。IIs型限制性內切酶的酶切序列和識別序列不同，目標DNA片段末端可以引入精心設計的IIs型酶位點，通過酶切，酶的識別序列與DNA片段分離，留下粘性末端，用于DNA多片段的無痕組裝。然而在組裝長片段DNA的過程中，不能忽視組裝的效率，即有多少比例的DNA片段可以正確連接成目的長片段。提高該比率是任何一個新方法都必須面臨的問題。以Goldengate DNA shuffling為例，研究者們通過不斷優化反應體系中的各種參數來實現高效組裝。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種阻遏環狀質粒中的目的片段和骨架載體酶切后重新連接的方法。

本發明提供的阻遏環狀質粒中的目的片段和骨架載體酶切后重新連接的方法包括如下步驟：

1)在環狀質粒的目的片段兩側添加DNA片段甲和DNA片段乙，得到環狀重組載體，所述環狀重組載體從上游起依次包括所述DNA片段甲、所述目的片段、所述DNA片段乙和所述骨架載體；

所述DNA片段甲的兩端分別為限制性內切酶A的識別切割序列和限制性內切酶B的識別切割序列，

所述DNA片段乙的兩端分別為限制性內切酶C的識別切割序列和限制性內切酶D的識別切割序列；

用所述限制性內切酶A、所述限制性內切酶B、所述限制性內切酶C和所述限制性內切酶D酶切所述環狀重組載體后形成的黏性末端依次記作：骨架載體黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、目的片段上游黏性末端、目的片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架載體黏性末端2；