[發明專利]一種利用短鏈引物阻遏提高DNA克隆及組裝效率的方法有效

申請號：	201510849165.0	申請日：	2015-11-27
公開（公告）號：	CN106811459B	公開（公告）日：	2019-09-27
發明（設計）人：	戴俊彪;林繼偉;秦怡然;吳慶余;何江海洋	申請（專利權）人：	清華大學;無錫青蘭生物科技有限公司
主分類號：	C12N15/10	分類號：	C12N15/10;C12N15/63;C12N15/11
代理公司：	北京紀凱知識產權代理有限公司 11245	代理人：	關暢;白艷
地址：	100084 北京市海淀區1***	國省代碼：	北京;11
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摘要：
搜索關鍵詞：	原載體短鏈引物組裝效率阻遏兩段酶切組裝限制性內切酶位點克隆載體骨架序列目標DNA片段互補配對粘性末端隔開切下條鏈匹配
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【權利要求書】：

1.一種阻遏環狀質粒中的目的片段和骨架載體酶切后重新連接的方法，包括如下步驟：

1）在環狀質粒的目的片段兩側添加DNA片段甲和DNA片段乙，得到環狀重組載體，所述環狀重組載體從上游起依次包括所述DNA片段甲、所述目的片段、所述DNA片段乙和所述骨架載體；

所述DNA片段甲的兩端分別為限制性內切酶A的識別切割序列和限制性內切酶B的識別切割序列，

所述DNA片段乙的兩端分別為限制性內切酶C的識別切割序列和限制性內切酶D的識別切割序列；

用所述限制性內切酶A、所述限制性內切酶B、所述限制性內切酶C和所述限制性內切酶D酶切所述環狀重組載體后形成的黏性末端依次記作：骨架載體黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、目的片段上游黏性末端、目的片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架載體黏性末端2；

所述黏性末端滿足如下條件：

所述目的片段上游黏性末端與所述骨架載體黏性末端1和所述骨架載體黏性末端2均不匹配，

所述目的片段下游黏性末端與所述骨架載體黏性末端1和所述骨架載體黏性末端2均不匹配，

所述目的片段上游黏性末端與所述目的片段下游黏性末端不同且不匹配；

2）用所述限制性內切酶A、所述限制性內切酶B、所述限制性內切酶C和所述限制性內切酶D酶切所述環狀重組載體，得到酶切產物；

3）將所述酶切產物、短鏈引物A和短鏈引物B退火，即實現了阻遏所述目的片段和所述骨架載體酶切后重新連接；

所述短鏈引物A與所述DNA片段甲互補配對，以阻遏所述目的片段和所述骨架載體酶切后重新連接；

所述短鏈引物B與所述DNA片段乙互補配對，以阻遏所述目的片段和所述骨架載體酶切后重新連接。

2.一種用于將m個待拼接DNA片段拼接到接收載體上的成套產品，其由m個環狀重組載體、接收載體x、短鏈引物A和短鏈引物B組成；

所述m個環狀重組載體按照待拼接DNA片段的拼接順序依次命名為環狀重組載體1、環狀重組載體2、……、環狀重組載體m；

所述m為大于等于2小于等于7的整數；

所述環狀重組載體1從上游起依次包括DNA片段甲1、待拼接DNA片段1、DNA片段乙1和骨架載體；

所述環狀重組載體2從上游起依次包括DNA片段甲2、待拼接DNA片段2、DNA片段乙2和骨架載體；

依次類推，

所述環狀重組載體m從上游起依次包括DNA片段甲m、待拼接DNA片段m、DNA片段乙m和骨架載體；

所述接收載體x從上游起依次包括DNA片段甲x、待替換DNA片段x、DNA片段乙x和骨架載體；

每個所述環狀重組載體中的DNA片段甲的兩端分別為限制性內切酶A的識別切割序列和限制性內切酶B的識別切割序列，

每個所述環狀重組載體中的DNA片段乙的兩端分別為限制性內切酶C的識別切割序列和限制性內切酶D的識別切割序列，

用所述限制性內切酶A、所述限制性內切酶B、所述限制性內切酶C和所述限制性內切酶D酶切每個所述環狀重組載體后形成的黏性末端依次記作：骨架載體黏性末端1、DNA片段甲上游黏性末端、DNA片段甲下游黏性末端、待拼接DNA片段上游黏性末端、待拼接DNA片段下游黏性末端、DNA片段乙上游黏性末端、DNA片段乙下游黏性末端、骨架載體黏性末端2；

所述黏性末端滿足如下條件：

每個所述待拼接DNA片段上游黏性末端與任一個環狀重組載體的骨架載體黏性末端1和任一個環狀重組載體的骨架載體黏性末端2均不匹配；

每個所述待拼接DNA片段下游黏性末端與任一個環狀重組載體的骨架載體黏性末端1和任一個環狀重組載體的骨架載體黏性末端2均不匹配；

每個所述待拼接DNA片段上游黏性末端與所述待拼接DNA片段下游黏性末端不同且不匹配；

待拼接DNA片段1下游黏性末端與待拼接DNA片段2上游黏性末端匹配；

待拼接DNA片段2下游黏性末端與待拼接DNA片段3上游黏性末端匹配；

依次類推；

待拼接DNA片段m-1下游黏性末端與待拼接DNA片段m上游黏性末端匹配；

所述接收載體x經限制性內切酶酶切產生的載體骨架上游黏性末端與待拼接DNA片段1上游黏性末端匹配；

所述接收載體x經限制性內切酶酶切產生的載體骨架下游黏性末端與待拼接DNA片段m下游黏性末端匹配；

所述短鏈引物A與所述DNA片段甲互補配對，以阻遏待拼接DNA片段和所述重組環狀載體的骨架載體酶切后重新連接；

所述短鏈引物B與所述DNA片段乙互補配對，以阻遏待拼接DNA片段和所述重組環狀載體的骨架載體酶切后重新連接。