[發明專利]檢測SCA致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒

在審

• 申請號: 201510849116.7
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105349662A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 王培昌;劉辰庚
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

技術領域

本發明屬分子生物學技術領域，涉及檢測SCA致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒。

背景技術

SCA(Spino-cerebellarataxias)是一種脊髓小腦共濟失調疾病，現有的檢測SCA的致病基因技術主要是基于單個突變位點的PCR和測序方法及單基因芯片方法，顯著缺點主要在于僅僅能檢測單個突變位點，不能對多個突變位點進行同時檢測，也不能對分布于多個外顯子的位點進行同時檢測。

發明內容

本發明的目的在于克服上述不足，提供一種檢測SCA致病基因突變的方法，其解決了現有技術中進行SCA致病基因突變檢測程序繁瑣、費用昂貴、費時、易污染和靈敏度低等問題。

為了實現上述目的，本發明采用的技術方案為：一種檢測SCA致病基因突變的方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：

樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存；

DNA提取，取220μL抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：

1)加220μLBufferBL，震蕩混合，于70℃孵育10min；

2)加220μL無水乙醇震蕩混合約20sec；

3)12000rpm離心1min；

4)取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2min；

5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μLHBsolution，室溫放置5min；

6)12000rpm離心2min；

7)加入700μLwashBuffer，12000rpm離心2min；

8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm離心2min；

9)棄收集管內液體，12000rpm離心2min；

10)將收集柱放入一個新的1.5ml離心管內，加入50μL70℃預熱的洗脫液,室溫放置1-2min，12000rpm離心2min，濾液即為模板DNA；

PCR擴增

PCR反應體系：

10×PCRBuffer2μL；

HotStarTaqDNAPolymerase按kit標準調整；

dNTPmix2μL；

上游引物PrimerU1μL；

下游引物PrimerL1μL；

DNA模板xμL；

滅菌蒸餾水20μL---上述總體積；

PCR產物電泳：1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；

PCR產物純化

每管內加入100μLPCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000rpm離心2min；

棄收集管內液體，加入700μLwashingbuffer，12000rpm離心2min；

棄收集管內液體，加入400μLwashingbuffer，12000rpm離心2min；

棄收集管內液體，12000rpm離心2min；

柱內加入30μL70℃預熱洗脫液，12000rpm離心3min；

測序反應

反應體系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+1μLPCR純化產物+3.5μLddH₂O；

測序PCR熱循環條件：

1)變性的條件，96℃10sec；

5)退火的條件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25個循環；

6)延伸的條件，60℃4min；

7)4℃保溫；

每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；

測序產物純化

10μL反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；

1)每管加入100μL100％酒精，或每管加入1μL125mMEDTA到管底，或每管加入1μL3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min；

2)10℃，4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min；

3)每管加入100μL70％酒精，離心15min；5℃，3600rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min；

4)室溫揮發凈酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；

5)95℃變性5min，4℃保溫4min，加樣上機；