[發明專利]檢測SCA致病基因突變的方法，及其引物、試劑盒

在審

• 申請號: 201510849116.7
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105349662A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 王培昌;劉辰庚
• 申請（專利權）人: 首都醫科大學宣武醫院
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京愛普納杰專利代理事務所(特殊普通合伙) 11419
• 代理人: 何自剛

1.一種檢測SCA致病基因突變的方法，不用于疾病的診斷和治療，其特征在于，其包括如下實現步驟：

樣本處理：取外周血2ml于EDTA抗凝管中，輕柔地顛倒混勻，4℃保存；

DNA提取，取220μL抗凝血用試劑盒提取DNA，包括：

1)加220μLBufferBL，震蕩混合，于70℃孵育10min；

2)加220μL無水乙醇震蕩混合約20秒；

3)12000rpm離心1min；

4)取上清轉入收集柱中，12000rpm離心2min；

5)將收集柱置一個新的收集管上，加入500μLHBsolution，室溫放置5min；

6)12000rpm離心2min；

7)加入700μLwashBuffer，12000rpm離心2min；

8)將收集柱置一個新的收集管上，加入700μLwashBuffer，12000rpm離心2min；

9)棄收集管內液體，12000rpm離心2min；

10)將收集柱放入一個新的1.5ml離心管內，加入50μL70℃預熱的洗脫液,室溫放置1-2min，12000rpm離心2min，濾液即為模板DNA；

PCR擴增

PCR反應體系：

10×PCRBuffer2μL；

HotStarTaqDNAPolymerase按kit標準調整；

dentmix2μL；

上游引物PrimerU1μ1；

下游引物PrimerL1μL；

DNA模板xμL；

滅菌蒸餾水20μL---上述總體積；

PCR產物電泳：1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增結果；

PCR產物純化

每管內加入100μLPCR-A液，混勻，轉入純化柱內，12000rpm離心

2min；

棄收集管內液體，加入700μLwashingbuffer，12000rpm離心2min；

棄收集管內液體，加入400μLwashingbuffer，12000rpm離心2min；

棄收集管內液體，12000rpm離心2min；

柱內加入30μL70℃預熱洗脫液，12000rpm離心3min；

測序反應

反應體系：0.8μLBigDye+1.5μLBigDyeSeqBuffer+3μL引物+

1μLPCR純化產物+3.5μLddH₂O；

測序PCR熱循環條件：

1)變性的條件，96℃10sec；

2)退火的條件，(首先96℃10sec，其次50℃5sec，然后60℃4min)×25個循環；

3)延伸的條件，60℃4min；

4)4℃保溫；

每一步的時間應從反應混合液達到所要求的溫度后開始計算；

測序產物純化

10μL反應體系，96孔板，酒精/EDTA/NaAc法；

1)每管加入100μL100％酒精，或每管加入1μL125mMEDTA到管底，或每管加入1μL3MNaAc到管底，然后震蕩混勻，室溫放置15min；

2)10℃，4000rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min；

3)每管加入100μL70％酒精，離心15min；5℃，3600rpm離心30min，馬上倒置，1200rpm離心1min；

4)室溫揮發凈酒精，加入10μLHi-DiFormamide溶解DNA；

5)95℃變性5min，4℃保溫4min，加樣上機；

6)測序純化：使用ABIBigdyeXTerminatorpurificationkit；

PCR檢測，包括：

1)對照孔的設立和檢測重復孔：樣本檢測同時設有對照實驗，包括陰性對照；對照和樣本均采用復孔；

在SCA基因突變位點兩端設計三對特異性引物；

所述引物是SCA1、SCA2和SCA3，

所述引物SCA1的sense為：

5'ACCTTCCAGTTCATTGGGTC3'，

所述引物SCA1的antisense為：

5'GTGTGTGGGATCATCGTCTG3'，

所述引物SCA2的sense為：

5'CTCCCTCCGCCTCAGACTGTT3'，

所述引物SCA2的antisense為：

5'CTGGACAGGCCTGACAATCCC3'，

所述引物SCA3的sense為：

5'TTCCTAAGATCAGCACTTCC3'，

所述引物SCA3的antisense為：

5'GATAAAGTGTGAAGGTAGCG3'；

所述引物PCR擴增出目的片段模板；

所述目的片段的獲取包括：以上述引物分別對人基因組DNA進行PCR擴增得到條帶單一的目的基因片段；將目的片段稀釋至1萬-10萬倍，終濃度為10-20ng/μL，作為檢測陰性對照用；

2)25μL反應體系檢測：

混合均勻；所有樣本混合完后，將ABIVeritiDxPCR系統儀器中進行程序性檢測；

結果分析及判定：對PCR產物進行測序分析。