[發明專利]檢測桑丁香假單胞菌的引物及其應用

有效

• 申請號: 201510844991.6
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105506072B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發明（設計）人: 吳福安;包奇;周雨;曹夢琪;王俊;盛晟
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

本發明公開了一種檢測桑丁香假單胞菌的引物及其應用，其正義引物Psm240F序列為：5'?AAGGTAACGGGGCTAAT?3'，反義引物Psm434R序列為：5'?GCTGTTGACCGATGATAT?3'。本發明基于桑丁香假單胞菌區別于其他丁香假單胞菌致病變種的特異性致病基因片段(hrpZ gene)設計和篩選了一對特異性引物對Psm240F/Psm434R，同時利用該引物對建立一種桑丁香假單胞菌的熒光定量PCR檢測方法，具有特異性好、靈敏度高的特點，且大大縮短了檢測所需時間，從樣品處理至得出結果只需4～5h。因此該方法適用于桑疫病的早期診斷。

技術領域

本發明為一種檢測桑丁香假單胞菌的引物及其應用，專用于檢測桑丁香假單胞菌，屬于農作物病害診斷與防治技術領域。

背景技術

丁香假單胞菌細菌性病害(Pseudomonas syringae pathovars)是世界上分布最廣、危害最嚴重且最難防治的重大細菌性病害，于2012年被列為十大細菌性病害之首(Mansfield,J.et al,2012,13(6),614-629)。此病廣泛流行于熱帶、亞熱帶及溫帶地區，有40多個類型的致病變種，可對包括草本、灌木和喬本在內的200多種植物造成危害(Rudolph,K.W,1995,1,47-138)。該病害可造成農作物最高減產90％，每年在全球范圍內造成直接經濟損失高達350億美元，引起了人們的廣泛關注。

桑疫病(mulberry bacterial blight)是由桑丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae pv.mori)引起的，桑丁香假單胞菌屬于丁香假單胞菌的一個致病變種。桑疫病的發生主要是其病原菌通過植株葉片氣孔進入植株體內，并在植物維管束中進行大量繁殖，導致導管阻塞，植物水分運輸受阻，同時致病菌還不斷合成分泌大量的毒素蛋白破壞植株組織結構，使得植株最終表現出萎縮及腐爛癥狀，而植株的病變部位主要出現在植株的頂端或者嫩梢，故桑疫病又稱“爛頭病”。該病因發病周期短，蔓延態勢嚴峻，已成為制約蠶桑產業可持續發展的重要因素。桑疫病一旦發生，很難進行有效的根治，而處在潛伏期的植物組織從外觀上很難與正常組織分開，因此，快速有效的早期診斷對于控制桑疫病的蔓延和避免重大損失的發生具有重要意義。

快速、精確的早期病原菌檢測手段是提高病害檢測效率的基礎，也是降低生物防治成本的前提。對于丁香假單胞菌的檢測，目前最主要的有選擇性培養基和分子生物學的方法。選擇性培養基最早是由Mohan,S.K.等于1987年報道利用一種改良的KBC瓊脂培養基平板法快速檢測紫丁香和菜豆致病變種的丁香假單胞菌。Goszczynska,T.等在前人的基礎上作出改進，于1998年指出利用MT培養基可以進行丁香假單胞菌與其他病原菌的區分，從而達到檢測丁香假單胞菌的目的。目前使用的分離篩選丁香假單胞菌的培養基大多也是基于以上幾種培養基或改良而來的。指示植物檢測法是檢測病原菌的方法之一，但由于周期長，并且受季節性限制，因此該法不能廣泛應用于快速檢測丁香假單胞菌。

分子生物學方法主要包括普通PCR法及熒光定量PCR法。2005年，Zaccardelli,M.等根據番茄丁香假單胞菌的致病基因hrpZ為目的片段設計特異性引物利用PCR擴增對番茄丁香假單胞菌進行快速檢測。Rees George,J.等于2010年依據16S-23S rDNA序列的間隔區設計出特異性的引物對獼猴桃丁香假單胞菌進行PCR檢測。隨著病原菌檢測手段的不斷提高，2014年，Gallelli,A.等在普通PCR檢測方法的基礎上進行改進，利用熒光定量PCR方法對獼猴桃丁香假單胞菌進行快速檢測。熒光定量PCR方法近年來憑借其靈敏度高、可靠性強、穩健性好的三大優點而廣泛應用于食物病原菌及部分植物病原菌的快速檢測，具有良好的應用前景。然而，截止目前為止，尚未有文獻報道關于應用熒光定量PCR方法進行桑疫病病原菌的快速檢測。

因此本發明嘗試使用熒光定量PCR方法對桑疫病病原菌進行絕對定量，不但提高了檢測的特異性和靈敏度，而且可避免生產上對桑樹病害的誤判，同時也降低了病原菌檢測所需的時間，為桑疫病的早期診斷和及早防治打下了基礎。

發明內容