[發(fā)明專利]檢測桑丁香假單胞菌的引物及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510844991.6
• 申請日: 2015-11-27
• 公開（公告）號: CN105506072B
• 公開（公告）日: 2019-01-18
• 發(fā)明（設計）人: 吳福安;包奇;周雨;曹夢琪;王俊;盛晟
• 申請（專利權）人: 江蘇科技大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12N15/11
• 代理公司: 南京經緯專利商標代理有限公司 32200
• 代理人: 樓高潮

1.檢測桑丁香假單胞菌的引物在熒光定量PCR檢測中的應用，其特征在于包括以下步驟：

1）利用KB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)病原菌，制備病原菌菌懸液，同時采用Biospin細菌全基因組DNA提取試劑盒提取病原菌總DNA，制備菌液和DNA標準樣品；

2）特異性引物設計，對致病性的桑丁香假單胞菌設計了其特異性的引物對Psm240F/Psm434R，所述引物對為：正義引物Psm240F序列為：5'-AAGGTAACGGGGCTAAT-3'，反義引物Psm434R序列為：5'-GCTGTTGACCGATGATAT-3'；

3）實時熒光定量PCR檢測方法反應體系為：20 μL反應體系中，包含10 μL SYBR Premix Ex TaqⅡ(Tli RNaseH Plus)(2×)，0.8 μL Psm240F 10 μM ，0.8 μL Psm434R 10 μM ，0.4 μL ROX Reference Dye(50×)，2.0 μL模板為標準病原菌菌懸液和DNA稀釋液或待測樣品的菌懸液，6 μL雙蒸水；

4）實時熒光定量PCR檢測方法擴增程序為：兩步法擴增程序：第一步：95 ℃預變性10min；第二步：95 ℃變性15 s，60 ℃延伸31 s，反應共計45個循環(huán)，PCR完成后，按0.1 ℃/s升溫速率從72 ℃升至95 ℃進行融解曲線的分析驗證；

5）取步驟1）中得到的病原菌菌懸液經平板計數(shù)法定量并進行梯度稀釋，稀釋成9個不同的濃度梯度：1 × 10⁸ cfu/mL，5 × 10⁷ cfu/mL，1 × 10⁷ cfu/mL，5 × 10⁶ cfu/mL，1× 10⁶ cfu/mL，1 × 10⁵ cfu/mL，1 × 10⁴ cfu/mL，1 × 10³ cfu/mL，1 × 10² cfu/mL，同時，取步驟1）中病原菌的全基因組DNA經ND-1000 V3.7.1定量并10倍梯度稀釋，稀釋成6個不同的濃度梯度：6.0 ng/μL，6.0 × 10^-1 ng/μL，6.0 × 10^-2 ng/μL，6.0 × 10^-3 ng/μL，6.0 × 10^-4 ng/μL，6.0 × 10^-5 ng/μL，以不同濃度梯度的菌懸液和DNA為模板按照上述PCR反應體系和擴增程序進行擴增；反應結束后，根據(jù)各個濃度梯度的循環(huán)閾值（Ct）采用計算機自動繪制熒光定量PCR標準曲線。