[發明專利]一株高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應用

在審

• 申請號: 201510829228.6
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105238733A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發明（設計）人: 王書寧;黃海燕;胡烈杰;于文君;袁恒星
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

技術領域

本發明涉及基因重組工程菌及其應用，尤其涉及一種高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應用。

背景技術

鐵氧還蛋白是一類含鐵硫簇的酸性蛋白，其中的鐵硫簇又主要分為[4Fe4S]、[2Fe2S]、[3Fe4S]等類型。鐵氧還蛋白作為一種常見的電子載體，參與呼吸作用、光合作用、發酵等重要代謝過程。目前，商業上出售的只有來自菠菜的[2Fe2S]型鐵氧還蛋白，然而因物種差異，該鐵氧還蛋白在分析來自其他物種的酶的時候表現出不同的效率，且該蛋白價格非常昂貴，這在很大程度上限制了鐵氧化還原蛋白的應用和科學家對鐵氧還蛋白相關的酶和代謝過程的研究。

在已有的文獻報道中，大部分鐵氧還蛋白是從野生細菌等生物體中純化獲得的，也有通過異源表達來制備，但這些方法具有很多不足，比如消耗大量的時間，純化步驟繁瑣，表達量低，鐵氧還蛋白的鐵硫簇組裝不完整而活力較低，最終產量和純度較低等。基于此，研究和開發能夠高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法成為目前亟待解決的課題，經檢索，有關能夠高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其在發酵生產2[4Fe4S]鐵氧還蛋白中的應用還未見報道。

發明內容

針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應用。

本發明所述的高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-2[4Fe4S]Fd，該菌株含有2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述重組大腸桿菌是將2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體，制得重組質粒命名為pETDuet-2[4Fe4S]，并將制得的重組質粒轉入含有pCodonPlus和pRKISC質粒的E.coliC41(DE3)中獲得。

上述的高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌中，所述2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因優選來源于巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)DSM525。

本發明所述高效表達2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌在發酵生產2[4Fe4S]鐵氧還蛋白中的應用。

其中，所述重組大腸桿菌發酵生產2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法是：

(1)將重組大腸桿菌菌株以體積比1～5％的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源的TB培養基中，在37±1℃和180±10rpm轉速條件下培養2～3小時至OD_620nm為0.4～0.6，獲得菌液；

其中，上述TB培養基的配方及組分終濃度是：Tryptone12g/L，Yeastextract24g/L，Glycerol4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環素，終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素；

上述鐵硫源配方及組分終濃度是：檸檬酸鐵銨0.2-0.3g/L，L-半胱氨酸0.1-0.2g/L，檸檬酸鐵0.18-0.3g/L，FeSO₄·7H₂O0.25-0.4g/L；

(2)向制得的菌液中加入終濃度為0.5mM的IPTG，在16～37℃和180±10rpm轉速下誘導2.5～24小時，收集培養液離心，獲得含2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細胞；

(3)破碎細胞，分離純化制備2[4Fe4S]鐵氧還蛋白。

上述的應用中，步驟(2)所述IPTG優選在35～37℃和180rpm轉速下誘導10～20小時。

步驟(3)中破碎細胞的方法是：將離心后獲得的含2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細胞用含10％甘油的緩沖液A重懸后，采用超聲波破碎儀器進行細胞破碎，12,000轉/分鐘離心30min，取上清液用0.22um孔徑濾膜過濾，即獲得含有組氨酸標簽的2[4Fe4S]鐵氧還蛋白粗酶液。

步驟(3)中分離純化制備2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法是：