[發(fā)明專利]一株高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510829228.6
• 申請(qǐng)日: 2015-11-24
• 公開（公告）號(hào): CN105238733A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王書寧;黃海燕;胡烈杰;于文君;袁恒星
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一株高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichiacoli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-2[4Fe4S]Fd，該菌株含有2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因，其核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；所述重組大腸桿菌是將2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體，制得重組質(zhì)粒命名為pETDuet-2[4Fe4S]，并將制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pCodonPlus和pRKISC質(zhì)粒的E.coliC41(DE3)中獲得。

2.如權(quán)利要求書1所述的高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌，其特征在于，所述2[4Fe4S]鐵氧還蛋白基因來源于巴斯德梭菌(Clostridiumpasteurianum)DSM525。

3.權(quán)利要求書1所述高效表達(dá)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白中的應(yīng)用。

4.如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于，所述重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的方法是：

(1)將重組大腸桿菌菌株以體積比1～5％的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源的TB培養(yǎng)基中，在37±1℃和180±10rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)2～3小時(shí)至OD_620nm為0.4～0.6，獲得菌液；

其中，上述TB培養(yǎng)基的配方及組分終濃度是：Tryptone12g/L，Yeastextract24g/L，Glycerol4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環(huán)素，終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素；

上述鐵硫源配方及組分終濃度是：檸檬酸鐵銨0.2-0.3g/L，L-半胱氨酸0.1-0.2g/L，檸檬酸鐵0.18-0.3g/L，F(xiàn)eSO₄·7H₂O0.25-0.4g/L；

(2)向制得的菌液中加入終濃度為0.5mM的IPTG，在16～37℃和180±10rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)2.5～24小時(shí)，收集培養(yǎng)液離心，獲得含2[4Fe4S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細(xì)胞；

(3)破碎細(xì)胞，分離純化制備2[4Fe4S]鐵氧還蛋白。

5.如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，步驟(2)所述IPTG在35～37℃和180rpm轉(zhuǎn)速下誘導(dǎo)10～20小時(shí)。