[發(fā)明專利]一株重組大腸桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510829212.5
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105331569B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發(fā)明（設計）人: 王書寧;黃海燕;胡烈杰;于文君;李慧俐;袁恒星
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產(chǎn)權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

本發(fā)明公開了一株重組大腸桿菌，所述菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet?S33[2Fe2S]Fd，該菌株含有來源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述重組大腸桿菌是將[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet?1載體，制得重組質(zhì)粒命名為pETDuet?[2Fe2S]，并將制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pCodonPlus和pRKISC質(zhì)粒的E.coli C41(DE3)中獲得。本發(fā)明還公開了所述重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用，實驗證實：每升發(fā)酵培養(yǎng)物最終可以獲得23mg純化后的[2Fe2S]鐵氧還蛋白，遠大于之前報道的從野生菌中純化出來的0.03mg的產(chǎn)量，預示本發(fā)明提供的重組大腸桿菌在工業(yè)化生產(chǎn)中具有很好的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及基因重組工程菌及其應用，尤其涉及一種用于發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應用。

背景技術

鐵氧還蛋白是一類含鐵硫簇的酸性蛋白，其中的鐵硫簇又主要分為[4Fe4S]、[2Fe2S]、[3Fe4S]等類型。鐵氧還蛋白作為一種常見的電子載體，參與呼吸作用、光合作用、發(fā)酵等重要代謝過程。目前，商業(yè)上出售的只有來自菠菜的[2Fe2S]型鐵氧還蛋白，然而因物種差異，該鐵氧還蛋白在分析來自其他物種的酶的時候表現(xiàn)出不同的效率，且該蛋白價格非常昂貴，這在很大程度上限制了鐵氧化還原蛋白的應用和科學家對鐵氧還蛋白相關的酶和代謝過程的研究。

在已有的文獻報道中，大部分鐵氧還蛋白是從野生細菌等生物體中純化獲得的，也有通過異源表達來制備，但這些方法具有很多不足，比如消耗大量的時間，純化步驟繁瑣，表達量低，鐵氧還蛋白的鐵硫簇組裝不完整而活力較低，最終產(chǎn)量和純度較低等。基于此，研究和開發(fā)能夠高效表達[2Fe2S]鐵氧還蛋白的方法成為目前亟待解決的課題，經(jīng)檢索，有關能夠高效表達[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其在發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用還未見報道。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術的不足，本發(fā)明的目的是提供一種高效表達2Fe2S鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌及其應用。

本發(fā)明所述的重組大腸桿菌，其特征在于，所述重組大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd，該菌株含有來源于根癌農(nóng)桿菌(Agrobacterium tumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示；所述重組大腸桿菌是將[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體，制得重組質(zhì)粒命名為pETDuet-[2Fe2S]，并將制得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入含有pCodonPlus和pRKISC質(zhì)粒的E.coli C41(DE3)中獲得。

本發(fā)明所述的重組大腸桿菌在發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用。

其中，所述重組大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)[2Fe2S]鐵氧還蛋白的方法是：

(1)將重組大腸桿菌菌株以體積比1～5％的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源的TB培養(yǎng)基中，在37±1℃和180±10rpm轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)2～3小時至OD_620nm為0.4～0.6，獲得菌液；

其中，上述TB培養(yǎng)基的配方及組分終濃度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract24g/L，Glycerol 4ml/L，KH₂PO₄2.3g/L，K₂HPO₄12.5g/L；

上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環(huán)素，終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素；