[發明專利]一株重組大腸桿菌及其在發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白中的應用

有效

• 申請號: 201510829212.5
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105331569B
• 公開（公告）日: 2019-08-13
• 發明（設計）人: 王書寧;黃海燕;胡烈杰;于文君;李慧俐;袁恒星
• 申請（專利權）人: 山東大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12P21/02;C12R1/19
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 李健康

1.一株重組大腸桿菌發酵生產[2Fe2S]鐵氧還蛋白的方法，步驟是：

(1)構建高效表達[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌，將重組大腸桿菌菌株以體積比1～5％的接種量接種到含有抗生素和鐵硫源的TB培養基中培養，獲得菌液；

其中，

上述TB培養基的配方及組分終濃度是：Tryptone 12g/L，Yeast extract 24g/L，Glycerol 4ml/L，KH₂PO₄ 2.3g/L，K₂HPO₄ 12.5g/L；

上述抗生素分別是終濃度為25μg/ml的氯霉素，終濃度為10μg/ml的四環素，終濃度為100μg/ml的氨芐青霉素；

(2)向制得的菌液中加入終濃度為0.5mM的IPTG，在35～37℃和180rpm轉速下誘導10～24小時，收集培養液離心，獲得含[2Fe2S]鐵氧還蛋白的重組大腸桿菌細胞；

(3)破碎細胞，分離純化制備[2Fe2S]鐵氧還蛋白；

其特征在于：

上述重組大腸桿菌菌株的構建方法是將來源于根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)S33的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因連接入pETDuet-1載體，制得重組質粒命名為pETDuet-[2Fe2S]，并將制得的重組質粒轉入含有pCodonPlus和pRKISC質粒的E.coli C41(DE3)中獲得；該重組大腸桿菌命名為大腸桿菌(Escherichia coli)pCodonPlus/pRKISC/pETDuet-S33[2Fe2S]Fd，其含有核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的[2Fe2S]鐵氧還蛋白基因；

上述重組大腸桿菌菌株是在37±1℃和180±10rpm轉速條件下培養2～3小時至OD_620nm為0.4～0.6，獲得菌液；

上述鐵硫源配方及組分終濃度是：檸檬酸鐵銨0.2-0.3g/L，L-半胱氨酸0.1-0.2g/L，檸檬酸鐵0.18-0.3g/L，FeSO₄·7H₂O 0.25-0.4g/L。