[發(fā)明專利]一種基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)的阿爾法1B受體篩選模型

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510828138.5
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105255991A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 嚴(yán)明;何玲;張陸勇
• 申請（專利權(quán)）人: 中國藥科大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.腎上腺素α_1B受體拮抗劑藥物篩選模型，其特征在于，包括步驟：

(1)α_1B受體拮抗劑篩選模型的建立與優(yōu)化；

(2)陽性藥驗證模型可靠性；

(3)高通量篩選模型驗證。

2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于T25中培養(yǎng)的細(xì)胞貼壁度要達(dá)到80％，達(dá)到對數(shù)生長期，細(xì)胞密度為7.5×10⁵cells/mL。

3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于用于確定細(xì)胞數(shù)、驗證陽性藥及篩選α_1D拮抗劑試驗的CHO/α_1B細(xì)胞應(yīng)是復(fù)蘇后至少傳代3次且達(dá)到穩(wěn)定生長狀態(tài)的細(xì)胞。于實驗前將其用PBS潤洗細(xì)胞一次，接著用0.5mMEDTA消化，離心，去除上層液體，最后將細(xì)胞用適量SB重懸至所需細(xì)胞密度。

4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于配置IP-one標(biāo)準(zhǔn)稀釋液、激動劑去氧腎上腺素(Phenylephrine)梯度稀釋液需按照給定濃度配置，細(xì)胞分別稀釋為5000cells/μL、2500cells/μL及1250cells/μL。

5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加樣方法：a：將配置好的IP1標(biāo)準(zhǔn)稀釋液加入384白板中，每孔10μl，三個復(fù)孔；b：將稀釋好的去氧腎上腺素溶液按每個濃度3個復(fù)孔，5μl每孔加入384孔板中，接著向其中分別加入配制好的不同濃度的細(xì)胞稀釋液5μl。此時標(biāo)準(zhǔn)曲線和反應(yīng)孔反應(yīng)體積均為10μl。將TopSeal-A膜貼于板面并37℃孵育1h。

6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于終止試劑配置：用Lysisbuffer(LB)將IP1-d2及anti-IP1稀釋33倍，按1∶1混勻平衡室溫后加入各孔，每孔10μL。將384孔板在500rpm下離心5s，使20μL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育1h。

7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于配制α_1B拮抗劑HEAThydrochloride梯度稀釋液方法為：拮抗劑HEAThydrochloride母液濃度為100mM，用IP1StimulationBuffer逐級稀釋為終濃度的3倍。

8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于加樣方法：將稀釋好的HEAThydrochloride溶液按每個濃度3個復(fù)孔，2.5μL每孔加入384孔板中。將配制的細(xì)胞溶液按每孔5μL加入384孔板中。將384孔板在500rpm下離心5s，使7.5μL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于室溫下使之孵育15min。將去氧腎上腺素母液稀釋成步驟(2)中測定的EC₈₀，每孔2.5μl加入對應(yīng)的含HEAThydrochloride的384孔板中。將384孔板在500rpm下離心5s，使10μL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。為防止試劑蒸發(fā)造成損失，將TopSeal-A膜貼于板面并將板放于37℃/5％CO₂下使之孵育45min。

9.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于配制終止試劑。向每孔加入10μLIP1-d2/anti-IP1溶液(1∶1)。將384孔板在500rpm下離心5s，使20μL試劑混合均勻以充分反應(yīng)。重新貼上TopSeal-A膜并將板放于室溫下繼續(xù)孵育1h。

10.權(quán)利要求1-10中所述任一所述的方法在篩選腎上腺素α_1B受體拮抗劑藥物的應(yīng)用。