[發(fā)明專利]一種制備胰凝乳蛋白酶的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510826531.0
• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105368810A
• 公開（公告）日: 2016-03-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;趙葉華;劉翠珍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類號: C12N9/76
• 分類號: C12N9/76
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，從合格的動物胰臟中制備胰凝乳蛋白酶的方法。

背景技術(shù)

胰凝乳蛋白酶chymotrypsin，是一種典型的絲氨酸蛋白酶，脊椎動物的消化酶。EC3.421.1。在胰臟中以酶前體物質(zhì)胰凝乳蛋白酶原的形態(tài)生物合成，隨胰液分泌出去。在小腸受到胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的一定的分解，轉(zhuǎn)變成活性的胰凝乳蛋白酶。

胰凝乳蛋白酶經(jīng)濟(jì)價(jià)值極高，在醫(yī)藥方面主要作為治療藥物：（1）.用于創(chuàng)傷或手術(shù)后傷口愈合（2）抗炎及防止局部水腫、積血、扭傷血腫（3）乳房手術(shù)后浮腫、中耳炎、鼻炎等（4）本品對眼球睫狀韌帶有選擇性松解作用，故可用于白內(nèi)障摘除，使晶狀體比較容易地移去。

藥用的胰凝乳蛋白酶主要從牛胰臟中提取，而本發(fā)明是靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液鹽溶、硫酸銨鹽析等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，使用磷酸鹽、丙酮、硫酸銨等價(jià)格便宜的輔料，制備胰凝乳蛋白酶，不僅在一定程度上降低了成本，且產(chǎn)品的收率也能達(dá)到20萬單位/kg胰臟。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的是從合格的動物胰臟中提取胰凝乳蛋白酶。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：將合格的動物胰臟經(jīng)過絞碎后，靈活運(yùn)用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨鹽析結(jié)晶等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰凝乳蛋白酶的方法。本發(fā)明操作簡單、成本低，非常適合于規(guī)模化大生產(chǎn)。包括如下步驟：

（1）水解：將新鮮或冷凍豬胰臟絞碎置于容器中，加入2~5倍量0℃以下的丙酮，在0℃左右攪拌脫水0.5~1.5小時(shí)，離心得沉淀物，加入0.5~1.5倍量的水及0.01~0.02倍量胰酶攪拌溶解，用6%~10%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值至6.0~9.0，于15℃~25℃保溫?cái)嚢?~3小時(shí)，再加入硅藻土充分?jǐn)嚢瑁^濾；

（2）沉淀：收集濾液與1.5~3倍量丙酮攪勻，靜置10~14小時(shí)，虹吸棄去上層丙酮清液，用1.5~2倍量丙酮分3～4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，即得胰凝乳蛋白酶粗品；

（3）提純：將粗品與45~60倍量磷酸緩沖液攪拌0.5~1.5小時(shí)，于15℃~25℃靜置15~25小時(shí)，按照溶液的體積加入其量約3%~7%的硅藻土拌勻，過濾。往濾液中加入硫酸銨，至硫酸銨濃度達(dá)35%~45%。過濾，得鹽析物；將鹽析物再按1g:8~10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，0℃~8℃下靜置48~72小時(shí)，慢慢形成針狀結(jié)晶，過濾；

（4）干燥：濾取晶體并用水沖洗3~5次，冷凍干燥，即可得胰凝乳蛋白酶。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

所述的利用胰酶水解、丙酮沉淀、磷酸緩沖液提純及硫酸銨結(jié)晶等現(xiàn)代蛋白純化技術(shù)，制備胰凝乳蛋白酶的方法，包括如下步驟：

1.水解：將新鮮豬胰臟絞碎置于容器中，加入3倍量0℃的丙酮，在0℃左右攪拌脫水1小時(shí)，離心得沉淀物，加入1倍量水及0.015倍量胰酶攪拌溶解，用8%氫氧化鈉溶液調(diào)至pH值至7.5,于20℃保溫?cái)嚢?小時(shí)，再加入0.01倍量硅藻土充分?jǐn)嚢瑁^濾。

2.沉淀：收集濾液與2倍量丙酮攪勻，靜置12小時(shí)，虹吸棄去上層丙酮清液，用2倍量丙酮分4次洗滌沉淀物，過濾甩干，干燥，約得120g胰凝乳蛋白酶粗品。

3.提純：將粗品與52倍量磷酸緩沖液攪拌混合1小時(shí)，于20℃靜置20小時(shí)，加入其量約5%的硅藻土拌勻，過濾。往濾液中加入硫酸銨至濃度達(dá)40%，過濾，約得35g鹽析物；將鹽析物再按1g:10ml的比例溶于碳酸緩沖液，然后在攪拌下逐滴加入飽和硫酸銨溶液，直至微渾，4℃下靜置72小時(shí)，慢慢形成針狀結(jié)晶，過濾。

4.干燥：濾取晶體并用水沖洗3次，冷凍干燥，約可得4.5g胰凝乳蛋白酶。

以上所述，僅是本發(fā)明的較佳實(shí)施例而已，并非是對本發(fā)明作其它形式的限制，任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述揭示的技術(shù)內(nèi)容加以變更或改型為等同變化的等效實(shí)施例。但是凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對以上實(shí)施例所作的任何簡單修改、等同變化與改型，仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案的保護(hù)范圍。