[發(fā)明專利]一種抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法

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• 申請日: 2015-11-25
• 公開（公告）號: CN105349604A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊勁峰;吳文惠;孟嘵琴;包斌
• 申請（專利權(quán)）人: 榮成廣潤水產(chǎn)食品有限公司
• 主分類號: C12P21/06
• 分類號: C12P21/06;C07K1/16
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及肽的制備，尤其是一種從魷魚內(nèi)臟中得到抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法。

背景技術(shù)

隨著我國遠(yuǎn)洋捕撈業(yè)的迅速發(fā)展，魷魚已經(jīng)成為我國主要的水產(chǎn)加工原料。一直以來魷魚的加工利用基本停留在其胴體上，內(nèi)臟、足、耳等一些加工副產(chǎn)物利用率較低，而這些廢棄物中含有豐富的蛋白質(zhì)。魷魚內(nèi)臟約占魷魚濕重的15%，而魷魚內(nèi)臟含有約19%的蛋白質(zhì)。目前，魷魚內(nèi)臟采用酶解發(fā)酵法，可作為制造醬油或天然調(diào)味品的原料。國外如西班牙和日本已有魷魚醬油的生產(chǎn)與銷售，而國內(nèi)也有天然調(diào)味品研究報(bào)道。但是如何高效對魷魚內(nèi)臟進(jìn)行水解以得到活性短肽的研究較少。

心腦血管疾病是全球人類死亡的首因，動(dòng)脈硬化是其中最常見而重要的類型，至今還沒有良藥。近年研究發(fā)現(xiàn)短肽類活性物質(zhì)能夠抑制諸多器官如心、肺、腎、肝的纖維化。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)中魷魚內(nèi)臟利用率低、附加值小的不足，本發(fā)明提供一種工藝合理、操作可行、具有抗動(dòng)脈硬化活性、附加值高的抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法。

本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：一種抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，其特征在于：經(jīng)過下列工藝步驟：

(1)原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1︰1～3的比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液；

(2)酶解：將步驟(1)中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力0.5～1萬U的蛋白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為55±5℃，計(jì)時(shí)酶解；酶解完畢后，將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶10-15min，冷卻至室溫后，控溫離心，得到魷魚內(nèi)臟酶解液；

(3)酶解液分離：將步驟(2)中得到的魷魚內(nèi)臟酶解液用去離子水溶解，采用HP-20樹脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得魷魚內(nèi)臟短肽。

進(jìn)一步，本發(fā)明的一種抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，其還經(jīng)過下列工藝步驟：

(4)抗動(dòng)脈硬化活性評價(jià)：將步驟(3)得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制活性評價(jià)。

所述的蛋白酶為堿性蛋白酶、中性蛋白酶、胰蛋白酶、動(dòng)物蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶、木瓜蛋白酶中的一種。

所述的控溫離心是控制溫度4℃，離心機(jī)轉(zhuǎn)速控制6000～8000r/min，離心10～20min。

所述的HMG-CoA還原酶抑制活性評價(jià)，其方法為：圓底96孔平板孔內(nèi)注入2.5mmol/LHMG-CoA、2-8U/mgHMG-CoA還原酶、10mmol/LNADPH和魷魚內(nèi)臟短肽，構(gòu)成50μL的反應(yīng)體系；在37℃于337nm處每隔4min連續(xù)測定80min，通過NADPH吸光度的變化以評定魷魚內(nèi)臟短肽對HMG-CoA還原酶的抑制作用；

其HMG-CoA還原酶抑制率的計(jì)算公式為：；

其中，在計(jì)算公式中，R為抑制率(%)；

K_i和K_C分別為樣品和對照組的吸光度直線斜率。

本發(fā)明采用酶解法制備魷魚內(nèi)臟酶解液，魷魚內(nèi)臟酶解液采用HP-20樹脂柱進(jìn)行層析，依次以水、20%、60%、80%的甲醇溶液對酶解液進(jìn)行梯度洗脫，收集甲醇洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，最終得到具有抗動(dòng)脈硬化作用的活性短肽。本發(fā)明提取得到的魷魚內(nèi)臟短肽可作為藥劑學(xué)方面的輔料，可制成供臨床應(yīng)用片劑、軟膠囊劑、顆粒劑、沖劑、口服液、注射劑，其附加值高。本發(fā)明工藝合理、操作可行，適合規(guī)?；S生產(chǎn)，且提取得到的魷魚內(nèi)臟短肽進(jìn)行HMG-CoA還原酶抑制活性評價(jià)，證明具有抗動(dòng)脈硬化的活性。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。

實(shí)施例1

一種抗動(dòng)脈硬化魷魚蛋白質(zhì)短肽的分離方法，經(jīng)過下列工藝步驟：

(1)原料預(yù)處理：選取新鮮的魷魚內(nèi)臟為原料，放入組織搗碎機(jī)中搗碎，按照1︰2的比例加入去離子水，混勻，得魷魚內(nèi)臟漿液；

(2)酶解：將步驟(1)中得到的魷魚內(nèi)臟漿液放入容器中，加入酶活力8000U的堿性蛋白酶，置于預(yù)熱的恒溫水浴鍋中，恒溫溫度為55℃，計(jì)時(shí)酶解，每隔10min用玻璃棒攪拌一次；酶解完畢后，將酶解液置于沸水浴中加熱滅酶15min，冷卻至室溫后，控制溫度4℃，離心機(jī)轉(zhuǎn)速控制8000r/min，離心10min，得到魷魚內(nèi)臟酶解液；