[發明專利]一株無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌及其構建方法與應用

有效

• 申請號: 201510825249.0
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105316273B
• 公開（公告）日: 2019-08-30
• 發明（設計）人: 姜岷;吳若凡;馬江鋒;陳可泉;吳昊
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

技術領域

本發明屬于生物工程技術領域，具體涉及一株無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌及其構建方法與應用。

背景技術

L-天冬氨酸在醫藥、食品和化工等方面有著廣泛的用途。在醫藥方面，是氨基酸制劑的主要成分；在化工方面，可以作為制造合成樹脂的原料，大量用于合成環保材料聚天門冬氨酸；尤其在食品工業方面，L-天門冬氨酸是一種良好的營養增補劑，也是糖代用品阿斯巴甜的主要生產原料。具有良好的市場前景。

目前L-天冬氨酸主要以富馬酸為原料，采用生物酶法合成。由于采用全細胞或是細胞破碎后的粗酶液進行轉化，因此轉化體系中含有兩種可以催化富馬酸的酶，即富馬酸酶和L-天冬氨酸酶，前者催化富馬酸合成蘋果酸，后者催化富馬酸合成L-天冬氨酸。副產物蘋果酸的合成不僅降低了目標產物的轉化率，同時也增加了下游產物分離純化的難度。因此構建一株具有高活性的L-天冬氨酸酶活性且無富馬酸酶活性或低富馬酸沒活性的重組菌可有效降低L-天冬氨酸生產過程成本。

發明內容

本發明要求解決的技術問題是，提供一株無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌。

本發明還要解決的技術問題是，提供上述無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌的制備方法。

本發明最后要解決的技術問題是，提供上述無蘋果酸副產的L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌在制備L-天冬氨酸中的應用。

為解決上述技術問題，本發明采用如下技術方案：

一株無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，將耐銨型大腸桿菌BEW308中編碼富馬酸酶的基因fumA、fumB、fumC中的一個或幾個基因失活，再將編碼L-天冬氨酸酶基因插入到編碼富馬酸酶fumAC基因的位置，即得到無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，所述的大腸桿菌耐銨型大腸桿菌BEW308，該菌株的保藏號為CCTCCNO：M2013157。所述的CCTCCNO：M2013157菌株為一株銨根離子耐受型大腸桿菌，該菌株的具體信息在申請號為201310279778.6專利中已經公開。fumA和fumC這兩個基因在基因組上是相連的。fumA、fumB、fumC的基因的EcoGene登記號分別為EG10356，EG10357，EG10358。

其中，所述的編碼L-天冬氨酸酶基因其氨基酸序列如SEQIDNO：1所示。

其中，所述編碼L-天冬氨酸酶基因，其起始密碼子的上游有一段信號肽，該信號肽的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

上述的無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌的制備方法，包括如下步驟：

(1)將pKD46質粒轉入耐銨型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽性轉化子大腸桿菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態細胞；

(2)以pIJ773質粒為模板，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的序列為引物，PCR擴增得到fumB基因敲除片段；

(3)將步驟(2)得到的fumB基因敲除片段電轉化至大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態細胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；

(4)將步驟(3)得到的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化其中，42℃誘導FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株為fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB；

(5)人工合成在SEQIDNO：1起始密碼子ATG前添加了SEQIDNO：2所示核苷酸序列的基因敲除片段；(6)將步驟(4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB制備成感受態細胞，將pKD46質粒轉化其中，利用L-阿拉伯糖誘導其表達λ重組酶，再將其制備成感受態細胞；

(7)將步驟(5)中的核苷酸序列轉化至步驟(6)的含有λ重組酶的感受態細胞中，在安普抗性平板上篩選陽性重組子；

(8)將步驟(8)中的陽性重組子制備成感受態細胞，將pCP20質粒轉化將pCP20質粒轉化其中，42℃誘導FLP重組酶表達，在安普霉素抗性平板和無抗性的平板上進行雙挑實驗，在物抗性的平板上生長，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長的菌株即為無蘋果酸副產的產L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌BEW308-△fumB-△fumAC-aspC。