[發(fā)明專利]一株無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌及其構(gòu)建方法與應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510825249.0
• 申請(qǐng)日: 2015-11-24
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105316273B
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-08-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜岷;吳若凡;馬江鋒;陳可泉;吳昊
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/70;C12P13/20;C12R1/19
• 代理公司: 南京蘇高專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32204
• 代理人: 肖明芳

1.一株無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，其特征在于，將耐銨型大腸桿菌BEW308中編碼富馬酸酶的基因fumA、fumB、fumC失活，再將編碼L-天冬氨酸酶基因插入到編碼富馬酸酶fumAC基因的位置，即得到無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，所述的大腸桿菌耐銨型大腸桿菌BEW308，該菌株的保藏號(hào)為CCTCCNO：M2013157。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，其特征在于，所述的L-天冬氨酸酶基因的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌，其特征在于，所述編碼L-天冬氨酸酶基因，其起始密碼子的上游有一段信號(hào)肽，該信號(hào)肽的核苷酸序列如SEQIDNO：2所示。

4.權(quán)利要求1所述的無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)入耐銨型大腸桿菌BEW308中，篩選出陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子大腸桿菌BEW308-pKD46，利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達(dá)λ重組酶，再將大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態(tài)細(xì)胞；

(2)以pIJ773質(zhì)粒為模板，SEQIDNO：3和SEQIDNO：4所示的序列為引物，PCR擴(kuò)增得到fumB基因敲除片段；

(3)將步驟(2)得到的fumB基因敲除片段電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BEW308-pKD46制備成感受態(tài)細(xì)胞中，在安普抗性平板上篩選陽(yáng)性重組子；

(4)將步驟(3)得到的陽(yáng)性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42℃誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，在安普霉素抗性平板和無(wú)抗性的平板上進(jìn)行雙挑實(shí)驗(yàn)，在物抗性的平板上生長(zhǎng)，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長(zhǎng)的菌株為fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB；

(5)人工合成在SEQIDNO：1起始密碼子ATG前添加了SEQIDNO：2所示核苷酸序列的基因敲除片段，該片段還包括安普霉素抗性基因序列，并在兩端添加了fumAC的同源臂，具體序列見(jiàn)SEQIDNO：5；

(6)將步驟(4)得到的fumB基因失活的菌株BEW308-△fumB制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pKD46質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，利用L-阿拉伯糖誘導(dǎo)其表達(dá)λ重組酶，再將其制備成感受態(tài)細(xì)胞；

(7)將步驟(5)中的核苷酸序列轉(zhuǎn)化至步驟(6)的含有λ重組酶的感受態(tài)細(xì)胞中，在安普抗性平板上篩選陽(yáng)性重組子；

(8)將步驟(8)中的陽(yáng)性重組子制備成感受態(tài)細(xì)胞，將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化將pCP20質(zhì)粒轉(zhuǎn)化其中，42℃誘導(dǎo)FLP重組酶表達(dá)，在安普霉素抗性平板和無(wú)抗性的平板上進(jìn)行雙挑實(shí)驗(yàn)，在物抗性的平板上生長(zhǎng)，但不能在有安普霉素抗性的平板上生長(zhǎng)的菌株即為無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌BEW308-△fumB-△fumAC-aspC。

5.權(quán)利要求1所述的無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌在生產(chǎn)L-天冬氨酸中的應(yīng)用。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，利用無(wú)蘋(píng)果酸副產(chǎn)的產(chǎn)L-天冬氨酸酶重組大腸桿菌發(fā)酵得到發(fā)酵液，再利用發(fā)酵液催化富馬酸氨轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-天冬氨酸。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)L-天冬氨酸酶，其發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：酵母粉24g/L，蛋白胨10g/L，K₂HPO₄36mmol/L，MgSO₄10mmol/L，微量元素[CaCl₂.6H₂O0.74g/L，ZnSO₄.7H₂O0.18g/L，MnSO₄.H₂O20g/L，Na₂.EDTA20.1g/L，CuSO₄0.1g/L，CoCl₂0.104g/L,FeSO₄.7H₂O2g/L]2mL/L，溶劑為水，pH用NaOH調(diào)到7.2～7.5。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的發(fā)酵產(chǎn)L-天冬氨酸酶，其發(fā)酵過(guò)程中，溫度為28～30℃，pH為7.2～7.8，溶氧為5～40％。