[發明專利]熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201510824467.2
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105400873A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發明（設計）人: 王秀娟;梁惠;段衛濤;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾;程殿軍

技術領域

本發明涉及分子生物學、生物技術以及臨床分子診斷技術領域，特別是涉及熒光定量PCR法檢測TOP2A基因mRNA表達的引物、探針及試劑盒。

背景技術

乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一，在西方國家其發病率和病死率居腫瘤之首。近年來，在我國發病率也呈直線上升的趨勢，目前浸潤性乳腺癌已被視為全身性疾病，其預后的判斷及與預后相關的生物學標志物備受關注，由于許多患者亞臨床轉移灶，以及化療耐藥的出現，導致患者無瘤生存期縮短，檢測有關乳腺癌耐藥相關基因，對指導規范化治療尤為重要。

在乳腺癌的研究中發現，TOPOⅡα的基因表達和腫瘤細胞對拓樸異構酶抑制劑的敏感性明顯相關，TOP2A基因異常的病人可以明顯受益于含有拓樸異構酶抑制劑的輔助化療方案，TOP2A高表達的病人使用CEF方案進行治療可以降低61％的復發風險和51％的死亡風險，而TOP2A低表達的患者使用CEF方案只能降低6％的復發風險和10％的死亡風險。

TOP2A基因(TopoisomeraseⅡalpha，TOPⅡα)定位于17q11.2-22區域，編碼DNA拓樸異構酶Ⅱα，是核基質成分之一，在核內發揮作用，能調節核酸空間結構動態變化，參與DNA的復制、轉錄、重組及修復過程。

依托泊苷為細胞周期特異性抗腫瘤藥物，作用于DNA拓撲異構酶Ⅱ，形成藥物-酶-DNA穩定的可逆性復合物，阻礙DNA修復。研究發現，依托泊苷的敏感性依賴于其細胞TOPOⅡα蛋白的表達水平。TOPOⅡα高表達的患者可以從依托泊苷治療中獲益。因此使用TOP2A基因mRNA水平來評判患者對含蒽環類藥物治療方案，更為準確。

目前用于檢測TOP2AmRNA水平的方法主要有免疫組織化學法，該方法檢測時間長，判讀受主觀因素影響大，不能準確反映TOP2A的表達水平；而cDNA微陣列mRNA表達譜分析(基因芯片)方法又存在靈敏度低、易污染等問題。

發明內容

為了解決現有技術中的上述問題，本發明提供了一種熒光定量檢測TOP2A基因mRNA的引物對和Taqman探針，特異性強、靈敏度高，重復性好。

本發明提供的熒光定量檢測TOP2A基因mRNA的引物對A和Taqman探針A，其引物對A的核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示，Taqman探針A的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

本發明采用熒光PCR結合Taqman探針法，基于熒光定量PCR技術來檢測TOP2A的基因表達水平，設計了目的基因的cDNA擴增引物和特異性Taqman探針，當然地，Taqman探針的5’端標記有熒光報告基團，3’端標記有熒光淬滅基團。本發明優選報告基團為FAM，淬滅基團為MGB。引物和探針的核苷酸序列具體為：

引物對A：F：5’-AAGTTACCTGAAGCTC-3’(SEQIDNO:1)；

R：5’-GGAAGGTGTTTTTAG-3’(SEQIDNO:2)；

Taqman探針A：5’FAM-TCCCCTCTGAATT-MGB3’(SEQIDNO:3)。

本發明還提供了一種熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其包括以上所述的熒光定量檢測TOP2A基因的引物對A和Taqman探針A。

優選地，上述試劑盒中，還包括用于檢測內參基因B2MmRNA的引物對B和Taqman探針B，引物對B的核苷酸序列如SEQIDNO:4～5所示，Taqman探針B的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。優選Taqman探針B的報告基團為FAM，淬滅基團為MGB。選擇內參基因B2M的目的是為了增加檢測的準確性。相較于其它內參基因，實驗表明，B2M較GAPDH及GUSB等為內參的腫瘤和正常組內及組間的表達差異最小，穩定性最佳。

引物對B：F:5’-ATGCTTATACACTTACA-3’(SEQIDNO:4)，

R:5’-ACATGGACATGATCTTC-3’(SEQIDNO:5)；

Taqman探針B：5’FAM-GTAGGGTTATAATA-MGB3’(SEQIDNO:6)。

優選地，上述試劑盒中，還包括B2M標準品、TOP2A標準品。TOP2A標準品為含有梯度濃度TOP2A基因組質粒DNA的溶液，B2M標準品為含有梯度濃度B2M基因組質粒DNA的溶液，標準品是作為該試劑盒的陽性對照及用于標準曲線的制作。