[發明專利]熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的引物、探針及試劑盒

在審

• 申請號: 201510824467.2
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105400873A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發明（設計）人: 王秀娟;梁惠;段衛濤;趙平鋒
• 申請（專利權）人: 武漢海吉力生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12N15/11
• 代理公司: 北京匯澤知識產權代理有限公司 11228
• 代理人: 張瑾;程殿軍

1.熒光定量檢測TOP2A基因mRNA的引物對A和Taqman探針A，其特征在于，引物對A的核苷酸序列如SEQIDNO:1～2所示，Taqman探針A的核苷酸序列如SEQIDNO:3所示。

2.根據權利要求1所述的熒光定量檢測TOP2A基因的引物對A和Taqman探針A，其特征在于，Taqman探針A的核苷酸序列5’端標記的熒光報告基團為FAM，3’端標記的淬滅基團為MGB。

3.一種熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其特征在于，包括權利要求1或2所述的熒光定量檢測TOP2A基因的引物對A和Taqman探針A。

4.根據權利要求3所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其特征在于，還包括用于檢測內參基因B2MmRNA的引物對B和Taqman探針B，引物對B的核苷酸序列如SEQIDNO:4～5所示，Taqman探針B的核苷酸序列如SEQIDNO:6所示。

5.根據權利要求4所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其特征在于，還包括TOP2A標準品、B2M標準品和陰性對照品，TOP2A標準品為含有梯度濃度TOP2A基因組質粒DNA的溶液，B2M標準品為含有梯度濃度B2M基因組質粒DNA的溶液。

6.根據權利要求5所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其特征在于，還包括第一鏈cDNA合成體系，具體包括反轉錄酶1～5U、反轉錄10×RTBuffe適量、dNTPs1～2mM、TOP2A基因反轉錄引物對1～10pM、內參基因B2M反轉錄引物對1～10pM，用DEPC水補足至19.5μL；使用時加入樣本RNA0.5μg。

7.根據權利要求6所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒，其特征在于，試劑盒內共有五管試劑，分別為：

第一鏈cDNA合成體系；

熒光定量PCR檢測反應液：含有TaqDNA聚合酶1～2U、2.0～5.0mmolMgCl₂和0.2～0.8mmoldNTPs的Premix；引物對A1～10pM；Taqman探針A1～10pM；引物對B1～10pM；Taqman探針B1～10pM；DEPC水適量；

TOP2A標準品；

B2M標準品；

陰性對照品：DEPC水。

8.權利要求4～7任一所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒的使用方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)以腫瘤組織和癌旁正常組織為待檢樣品，提取待檢樣品中的RNA，反轉錄成樣品cDNA；

(2)以樣品cDNA作為模板，用引物對A、Taqman探針A、引物對B和Taqman探針B進行熒光定量PCR反應；TOP2A標準品和B2M標準品也分別進行與樣品cDNA同樣的操作，并根據TOP2A標準品和B2M標準品繪制標準曲線；

(3)結果分析：分析標準曲線的R²在0.99以上，TOP2A基因和B2M基因擴增效率應在94-100％范圍，再根據熒光定量PCR儀器給出的Ct值，進行如下計算：

△Ct(腫瘤組織)＝Ct(待檢腫瘤組織樣品)-Ct(B2M基因)；

△Ct(癌旁正常組織)＝Ct(待檢癌旁正常組織樣品)-Ct(B2M基因)；

△△Ct＝△Ct(腫瘤組織)-△Ct(癌旁正常組織)；

相對表達率＞1判斷為乳腺癌TOP2A基因高表達。

9.根據權利要求8所述的熒光定量PCR法檢測TOP2A基因表達的試劑盒的使用方法，其特征在于，步驟(2)中熒光定量PCR反應程序為：95℃預變性2min；95℃15s，60℃30s40個循環；當熒光基團選擇FAM時在60℃30s時采集熒光信號。