[發(fā)明專利]用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構(gòu)建方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510824077.5
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105400816A
• 公開（公告）日: 2016-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周慶;黃衛(wèi)人;劉宇辰;周澤強(qiáng);蔡志明
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市第二人民醫(yī)院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12Q1/68
• 代理公司: 深圳鼎合誠知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 44281
• 代理人: 向武橋

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及一種用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，也是全身十大常見腫瘤之一。目前的診治手段由于缺乏膀胱癌高特異性靶點(diǎn)等原因，不能有效地通過單靶點(diǎn)區(qū)分正常細(xì)胞和膀胱癌細(xì)胞，急需研發(fā)對膀胱癌更加特異的精準(zhǔn)治療方法。膀胱癌系統(tǒng)生物學(xué)和基因組學(xué)的研究，使人們有可能對腫瘤細(xì)胞基因突變以及潛在的治療靶點(diǎn)有比較全面的認(rèn)識和了解。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供一種新的用于檢測膀胱癌的試劑盒。

本發(fā)明提供一種用于膀胱癌檢測的邏輯與門基因線路的構(gòu)建方法，包括：

a)用PCR方法擴(kuò)增序列：如SEQIDNO:1所示的hUPII啟動(dòng)子序列，如SEQIDNO:2所示的氨酰tRNA合成酶AcKRS基因序列，SEQIDNO:3所示的hTERT啟動(dòng)子序列，如SEQIDNO:4所示的tRNA序列，如以SEQIDNO:5所示的pCMV6-AC-GFP質(zhì)粒序列為模板PCR擴(kuò)增SEQIDNO:6所示的pCMV6-AC-GFP37TAG質(zhì)粒序列；

b)將所述hUPII啟動(dòng)子與AcKRS基因，所述hTERT啟動(dòng)子與tRNA分別連接到如SEQIDNO:7所示的psiCHECK-2質(zhì)粒中構(gòu)建重組載體；

c)將所述重組載體與所述pCMV6-AC-GFP37TAG質(zhì)粒，共同轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞，構(gòu)建出所述基因線路。

所述膀胱癌細(xì)胞是5637。所述步驟c)中，將含有UAG終止密碼子的效應(yīng)基因一起轉(zhuǎn)入所述膀胱癌細(xì)胞。所述效應(yīng)基因是綠色熒光蛋白GFP。

一種尿道上皮細(xì)胞特異啟動(dòng)子hUPII與一種能在真核細(xì)胞編碼乙酰化賴氨酸的氨酰tRNA合成酶AcKRS組成的DNA序列，hUPII序列如SEQIDNO:1所示，AcKRS序列如SEQIDNO:2所示。

一種癌癥細(xì)胞特異啟動(dòng)子hTERT與一種能在真核細(xì)胞編碼乙酰化賴氨酸的tRNA組成的DNA序列，hTERT序列如SEQIDNO:3所示，tRNA序列如SEQIDNO:4所示。

當(dāng)將上述基因線路轉(zhuǎn)入膀胱癌細(xì)胞，并加入N-乙酰-L-賴氨酸時(shí)，綠色熒光蛋白只在膀胱癌細(xì)胞中表達(dá)，而在正常細(xì)胞中不表達(dá)。

一種膀胱癌檢測試劑盒，包括序列如SEQIDNO:8所示的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重組載體、序列如SEQIDNO:9所示的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重組載體、序列如SEQIDNO:6所示pCMV6-AC-GFP37TAG質(zhì)粒。所述的試劑盒，還包括含有UAG終止密碼子的效應(yīng)基因。所述效應(yīng)基因是綠色熒光蛋白GFP。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明將乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶AcKRS基因、乙酰化賴氨酸t(yī)RNA分別構(gòu)建在膀胱癌特異性啟動(dòng)子下游，并與含有UAG終止密碼子的效應(yīng)基因綠色熒光蛋白GFP一起轉(zhuǎn)入細(xì)胞，構(gòu)建的邏輯與門乙酰化賴氨酸基因線路只在膀胱癌細(xì)胞中啟動(dòng)乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶、乙酰化賴氨酸t(yī)RNA轉(zhuǎn)錄，在外源加入N-乙酰-L-賴氨酸的條件下，表達(dá)全長的綠色熒光蛋白GFP；而在其他類型細(xì)胞中，膀胱癌特異啟動(dòng)子無法同時(shí)啟動(dòng)乙酰化賴氨酸t(yī)RNA和乙酰化賴氨酸氨酰tRNA合成酶的轉(zhuǎn)錄，綠色熒光蛋白GFP基因翻譯時(shí)會(huì)在UAG終止密碼子處終止，不能表達(dá)全長的綠色熒光蛋白GFP；從而可以通過比較細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)弱或者Westernblot檢測GFP表達(dá)的方法，區(qū)分膀胱癌細(xì)胞和正常細(xì)胞。

附圖說明

圖1是跑膠檢測重組載體構(gòu)建情況，其中，字符1代表BglII/XhoI雙酶切后的psiCHECK-2-hUPII/AcKRS重組載體，箭頭所指hUPII/AcKRS的片段；2代表BglII/XhoI雙酶切后的psiCHECK-2-hTERT/tRNA重組載體，箭頭所指hTERT/tRNA的片段；3代表PCR定點(diǎn)突變的pCMV6-AC-GFP37TAG重組載體，箭頭所指pCMV6-AC-GFP37TAG的片段；