[發明專利]一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒

有效

• 申請號: 201510822325.2
• 申請日: 2015-11-23
• 公開（公告）號: CN105255995B
• 公開（公告）日: 2019-02-05
• 發明（設計）人: 蕭偉;曹澤彧;丁玥;曹亮;李娜;丁崗;王振中
• 申請（專利權）人: 江蘇康緣藥業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/66
• 分類號: C12Q1/66;C12Q1/37
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 趙青朵

本發明涉及醫藥技術領域，特別涉及一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒。該檢測方法包括：將編碼Gln?Gly的核苷酸序列插入熒光素酶質粒，經體外非細胞轉錄翻譯獲得含Gln?Gly的重組熒光素酶；體外重組表達手足口病毒蛋白酶，手足口病毒蛋白酶為2A或3C蛋白酶；手足口病毒蛋白酶與含Gln?Gly的重組熒光素酶、受試物發生酶促反應，檢測熒光素的生物發光強度，獲得受試物的抗手足口病藥物活性。本發明檢測方法具有簡單、微量、快速的優點，藥物篩選工作量小，實驗快速精確，實驗結果重復性好，可用于抗手足口病藥物的篩選與開發；本法基于螢光素酶的生物發光檢測方法，靈敏度高，干擾因素少，受試品兼容性強。

技術領域

本發明涉及醫藥技術領域，特別涉及一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒。

背景技術

手足口病是由病毒引起的兒科疾病，屬于我國法定丙類傳染病。0-6歲的嬰幼兒是該病的易感人群，其中以2-3歲兒童感染最為常見，患兒感染后首先在四肢及口腔等部位引起皰疹或潰瘍，多數患兒給予及時有效治療后可在1-2周內痊愈。然而，少數患兒病情進展迅速，可在發病1-5天左右出現中樞神經系統和心肺感染，具有較高的致死風險，存活病例仍可留有后遺癥。

根據世界衛生組織報告，能夠引起手足口病癥狀的病毒大約有20多種，其中以腸道病毒71型(enterovirus 71，EV71)和柯薩奇病毒A組16型(coxsachievirus A16，CoxA16)最為常見，其他能夠引起手足口病的病毒主要包括：柯薩奇病毒A組2、4、5、7、9和10型(CoxA2、CoxA4、CoxA5、CoxA7、CoxA9和CoxA10)，柯薩奇病毒B組1-5型(CoxB1-5)以及埃可病毒(ECHO)等。目前，尚沒有直接靶向病毒的特效藥物或預防性疫苗，臨床主要采取對癥治療的策略。這一現狀提示藥物研發人員仍需要對抗手足口病化合物或組合物深入研究和篩選。

手足口相關病毒的2A蛋白酶和3C蛋白酶常用作做篩選靶點，2A和3C蛋白酶屬于半胱氨酸蛋白酶，特異識別和切割蛋白質谷氨酰胺(Gln)和甘氨酸(Gly)之間的酰胺鍵。在病毒的生活史中主要參與干擾宿主蛋白合成、促進病毒蛋白原加工與成熟、協助病毒核酸復制以及啟動宿主細胞程序性死亡等。總的來說，2A和3C蛋白酶在手足口病毒的生活史中具有重要作用，同時也是一個良好的研究靶點。但是目前尚沒有針對該靶點的藥物正式上市，這暗示了針對該靶點的藥物篩選工作尚需要更新、更靈敏、更可靠的方法。

現有的手足口病毒蛋白酶抑制劑篩選方法主要有酶偶聯法、酵母雙雜交法和HPLC測定產物法。其中，酶偶聯法測定的精確度不高、線性范圍較窄，可重復性不佳；而酵母雙雜交法實驗周期長，干擾因素較多；HPLC測定產物法周期比較長、通量小、針對儀器和操作人員的技術壁壘比較高。正是因為篩選方法的瓶頸，嚴重制約了基于此靶點藥物的大規模、高通量篩選和發現。例如，輝瑞公司曾經采用酶偶聯法篩選得到3C蛋白酶抑制劑蘆平曲韋并進入開發階段(Dragovich et al.,J Med Chem,1999,42:1213–1224)，后因沒有明顯的臨床藥效宣告失敗。總之，截止目前，尚沒有基于此靶點的藥物正式獲批上市。因此，有必要建立快速、精確、干擾因素少的蛋白酶抑制劑篩選方法，從而推動蛋白酶抑制劑類的抗手足口藥物大量涌現。

發明內容

有鑒于此，本發明提供了一種抗手足口病藥物活性檢測方法及其試劑盒。該檢測方法具有簡單、微量、快速的優點，藥物篩選工作量小，實驗快速精確，實驗結果重復性好，可用于抗手足口病藥物的篩選與開發；本法基于螢光素酶的生物發光檢測方法，靈敏度高，干擾因素少，受試品兼容性強。

為了實現上述發明目的，本發明提供以下技術方案：

本發明提供了一種抗手足口病藥物活性檢測方法，包括如下步驟：

將編碼Gln-Gly的核苷酸序列插入熒光素酶質粒，經體外非細胞轉錄翻譯獲得含Gln-Gly的重組熒光素酶；

體外重組表達手足口病毒蛋白酶，手足口病毒蛋白酶為2A或3C蛋白酶；