[發明專利]一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物

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• 申請號: 201510820425.1
• 申請日: 2015-11-24
• 公開（公告）號: CN105384812A
• 公開（公告）日: 2016-03-09
• 發明（設計）人: 劉乃山;林曉磊;劉翠珍
• 申請（專利權）人: 青島康原藥業有限公司
• 主分類號: C07K14/81
• 分類號: C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/18;A61K38/57;A61P29/00;A61P37/04
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技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體地說涉及一種特異性樹脂處理再生提高柱效制備收率高、效價穩定的烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物。

背景技術

烏司他丁（ULinastatin）系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個氨基酸組成，相對分子質量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細胞彈性蛋白酶、透明質酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子（MDF）產生、清除氧自由基及抑制炎癥介質釋放的作用。烏司他丁還可改善手術刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術刺激引起的對內臟器官與細胞的損傷以及改善休克時的循環狀態等。

1909年歐洲首先報道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發現，當人體受到感染、發熱、腫瘤、妊娠、休克、手術、給予糖皮質激素等刺激時，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開發上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環衰竭的治療藥物被廣泛應用于臨床。

本發明人自2008年開始對UTI的生產工藝進行試驗研究，采用現代蛋白質高端生化分離技術進行生產，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，生產工藝穩定，質量可控。

發明內容

本發明提供了一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統方法提取烏司他丁收率過低、效價不高不穩定的缺點，采用特異性樹脂處理再生提高柱效法來純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價的穩定。

為解決上述技術問題，本發明采用以下技術方案予以實現：

一種樹脂再生提高柱效純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復溶性的藥物組合物，其特征在于：選用特異性樹脂處理再生法來純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價不低于5000iu/mg，柱效提高約50%。

該技術方案中，其技術特征還在于所述方法包括如下步驟：

1）烏司他丁粗加工

稱取1TpH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質吸附完全后用氨水洗脫，再經過3.5kg硫酸銨鹽析，過夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。

2）吸附柱層析（以0.25LDEAE樹脂柱為例）

2.1）將柱中的DEAE樹脂用純化水反沖下來，裝入桶中，用純化水浸沒攪勻，靜置，反復多次，純化水浸沒過夜；

2.2）將DEAE樹脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5mol/L鹽酸浸沒，攪拌，過濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡，攪拌，過濾，再用純化水洗至中性；

2.3）將上述經處理過的DEAE樹脂加洗脫液A反復平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；

2.4）將上述平衡好的樹脂裝入柱內，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；

2.5）稱取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60℃水浴攪拌加熱10小時；

2.6）將上述離心液流經平衡好的DEAE樹脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；

2.7）用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；

2.8）將洗脫液經超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。

3）親和層析（以0.25L柱體為例）

3.1）用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經平衡過的樹脂柱，流速控制在120~130mL/min；

3.2）上樣結束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；

3.3）柱中的親和樹脂經洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質，流速控制在120~130mL/min，密封待用；

3.4）洗脫液經超濾膜超濾至一定體積，超濾液中加入一定量磷酸氫二鈉溶液，繼續超濾至同一體積，然后再加入等量磷酸氫二鈉溶液，再經超濾膜超濾至相同體積。

4）沉淀