[發明專利]一種基孔肯雅熱病毒的恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201510817085.7
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105256058B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 馮燕;徐昌平;嚴菊英;盧亦愚;須周恒
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種基孔肯雅熱病毒的恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法，該試劑盒包含RNA提取試劑、恒溫PCR擴增反應液、陽性對照和陰性對照；本發明的檢測試劑盒特異性好、靈敏度高；從病毒RNA逆轉錄到鏈置換擴增全部恒定同一溫度，恒溫擴增僅需35分鐘，核酸試紙條檢測結果需2分鐘左右，全程從接受樣品到獲得結果整個檢測過程僅需1小時左右，且整個反應過程只需一個恒溫儀器，特別適合基孔肯雅熱病毒感染媒介監測的快速檢測使用。

(一)技術領域

本發明涉及一種針對基孔肯雅熱病毒核酸的恒溫擴增快速檢測技術，適合對基孔肯雅熱病毒的定性檢測。

(二)背景技術

基孔肯雅熱(Chikungunya fever,簡稱CHIK)是經伊蚊叮咬吸血傳播由CHIK病毒引起的一種急性傳染病,屬再肆虐的人獸共患病。臨床上以發熱、關節疼痛、皮疹和輕度出血為特征。該病主要流行于夏、秋季節，主要分布于非洲、南亞和東南亞地區，2005—2007年在印度洋島嶼、印度和東南亞地區廣泛流行，導致數百萬人患病。2008年我國發現首例輸入性病例，2010年在廣東出現暴發流行。近兩年,該病流行地區不斷擴大，且發病數不斷上升,成為重要的公共衛生問題。該病主要通過感染病毒的伊蚊叮咬而傳播，埃及伊蚊和白紋伊蚊為主要傳播媒介，CHIKV不需要外部非人類的儲存庫，只要存在人類宿主和合適的傳播媒介，就可能進行傳播。基孔肯雅熱近年來成為嚴重的蟲媒傳染病。基孔肯雅熱病毒感染需要實驗室診斷技術加以確診，因此建立快速、準確的診斷方法十分重要。目前基孔肯雅熱病毒的實驗室檢測技術主要基于針對病毒RNA的核酸檢測技術(如熒光定量PCR等技術)，但由于需要昂貴的熒光定量PCR儀，使得難以廣泛使用。恒溫擴增技術是繼PCR技術后近年發展起來的一種新的體外核酸擴增技術，本發明技術研制了恒溫擴增基孔肯雅熱病毒核酸，并結合核酸試紙條顯色來判定檢測結果，且整個反應過程不打開反應管蓋子，試紙條流動檢測過程密閉，杜絕了核酸擴增產物污染外界的可能性。本發明研發的基孔肯雅熱病毒核酸的恒溫擴增檢測試劑盒及其檢測方法檢測時間短、反應靈敏、方法特異，為基孔肯雅熱檢測提供了一種可靠的快速檢測方法。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種準確、靈敏、快速地檢測基孔肯雅熱病毒核酸的恒溫擴增檢測試劑盒及其檢測方法。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種基孔肯雅熱病毒恒溫擴增檢測試劑盒，所述試劑盒組成包括：

(1)RNA提取液，優選德國QIAGEN RNA提取試劑盒(Qia-74104)；

(2)恒溫擴增反應液，包括：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條交叉擴增引物、1×Thermol buffer、MgSO₄、dNTPs溶液、Bst DNA聚合酶、AMV逆轉錄酶和無菌雙蒸水；其中：

所述正向外圍引物為：5′-CTCTCCTCTCCACAGGTGTA-3′(SEQ ID NO.2所示)；

反向外圍引物為：5′-CGCAGTCTATGGAGATGTGC-3′(SEQ ID NO.3所示)；

所述兩條探針的序列分別為：

正向5’端Biotin標記探針

5′-Biotin-ATGGGAGAAGAAAATATCTGAGGC-3′(SEQ ID NO.4所示)；

反向3’端Fitc標記探針5′-Fitc-TGGTTCAGTGACTGGGTCAG-3′(SEQ ID NO.5所示)；

所述兩條擴增交叉引物分別為：

擴增正向引物：

5′-CCGTCGAGTCCATGGCTGTAAAACTCAGGAGGGAAAGACAGG-3′(SEQ ID NO.6所示)；