[發明專利]一種基孔肯雅熱病毒的恒溫擴增檢測試劑盒及檢測方法

有效

• 申請號: 201510817085.7
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105256058B
• 公開（公告）日: 2019-03-26
• 發明（設計）人: 馮燕;徐昌平;嚴菊英;盧亦愚;須周恒
• 申請（專利權）人: 浙江省疾病預防控制中心
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844;C12Q1/70
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種基孔肯雅熱病毒恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述試劑盒組成包括：

(1)RNA提取試劑；

(2)恒溫PCR擴增反應液：正向外圍引物、反向外圍引物、兩條探針、兩條擴增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO₄，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶，AMV逆轉錄酶和無菌雙蒸水；

所述正向外圍引物為：5′-CTCTCCTCTCCACAGGTGTA-3′；

反向外圍引物為：5′-CGCAGTCTATGGAGATGTGC-3′；

所述兩條探針的序列分別為：

正向5’端Biotin標記探針5′-Biotin-ATGGGAGAAGAAAATATCTGAGGC-3′；

反向3’端Fitc標記探針5′-Fitc-TGGTTCAGTGACTGGGTCAG-3′；

所述兩條擴增交叉引物分別為：

擴增正向引物：5′-CCGTCGAGTCCATGGCTGTAAAACTCAGGAGGGAAAGACAGG-3′；

擴增反向引物：

5′-GCAGACGTGGTCATCTACTGCC-ACTTGGGTCCGCATCTGT-3′；

(3)陽性對照：基孔肯雅熱病毒核酸；

(4)陰性對照：無菌雙蒸水。

2.如權利要求1所述基孔肯雅熱病毒恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述1×Thermol Buffer組成為：20mM的Tris-HCl、10mM的KCl、10mM的(NH₄)₂SO₄、2mM的MgSO₄以及質量濃度為0.1％的Triton X-100，pH 8.8。

3.如權利要求1所述基孔肯雅熱病毒恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述陽性對照為基孔肯雅熱病毒核酸，所擴增區域為長225bp的基孔肯雅熱病毒NSp4片段的基因，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

4.如權利要求1所述基孔肯雅熱病毒恒溫擴增檢測試劑盒，其特征在于所述恒溫PCR擴增反應液組成為：兩條外圍引物各自10pmol，兩條探針各自20pmol，兩條交叉引物各自40pmol，1×Thermol buffer，MgSO₄為7mmol，dNTPs溶液各0.1mmol，Bst DNA聚合酶8U，AMV逆轉錄酶5U，無菌雙蒸水組成補足至25μl。