[發明專利]一種高效聯產α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略

有效

• 申請號: 201510814936.2
• 申請日: 2015-11-23
• 公開（公告）號: CN105255934B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 饒志明;張冬竹;章暉;周俊平;楊套偉;張顯;徐美娟
• 申請（專利權）人: 安徽華恒生物科技股份有限公司
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12P13/00;C12P7/58
• 代理公司: 無錫華源專利商標事務所(普通合伙) 32228
• 代理人: 聶漢欽

本發明是一種串聯葡萄糖脫氫酶及L?氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯產α?氨基丁酸和葡萄糖酸的方法。將葡萄糖脫氫酶基因與L?氨基酸脫氫酶基因構建重組共表達載體并將其轉化至基因工程菌大腸桿菌內。同時構建好表達L?蘇氨酸脫氨酶的重組大腸桿菌。高效共表達葡萄糖脫氫酶及L?氨基酸脫氫酶于大腸桿菌中可以促進輔因子在菌體胞內的循環，不需要添加任何外源輔因子，利用該輔因子循環再生系統可以利用廉價底物L?蘇氨酸及葡萄糖聯產高附加值的α?氨基丁酸和葡萄糖酸，該轉化過程簡單快捷，成本低廉。在5L發酵罐中該方法所得的α?氨基丁酸和葡萄糖酸產量分別可達102.8g/L及196.8g/L，為其工業化生產提供了一種實際有效策略。

技術領域

本發明屬于微生物技術領域，具體涉及一種構建葡萄糖脫氫酶與L-氨基酸脫氫酶串聯到質粒上并在大腸桿菌中共表達，利用該重組大腸桿菌進行全細胞轉化高效制備α-氨基丁酸和葡萄糖酸鹽的方法。

背景技術

α-氨基丁酸是一種可以抑制人體神經信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強葡萄糖磷酸酯酶的活性，促進腦細胞代謝的作用。α-氨基丁酸作為一種重要的化工原料和醫藥中間體如抗結核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦的合成前體，具有廣闊的應用市場。α-氨基丁酸主要通過化學合成法、酶拆分法及酶轉化法來制備，在這三種方法之中，微生物酶轉化法具有特異性較強，條件溫和，對環境友好等優點。微生物酶轉化法制備α-氨基丁酸主要是通過利用L-氨基酸脫氫酶對酮丁酸進行轉氨催化作用完成，這之中需要輔因子NADH的參與，而輔因子NADH價格昂貴，顯然不適用于工業生產中。通過基因工程手段可以在細胞中構建輔酶偶聯再生系統，Degussa公司首次利用甲酸脫氫酶提供輔因子NADH的再生并且將其應用到L-叔亮氨酸的制備中，大大提高了產物的轉化率。

葡萄糖酸是化工、醫藥及食品等產品的重要中間體，可被用來生產葡萄糖酸的衍生物如與鈉、鈣、鋅、亞鐵等金屬氧化物合成制得的葡萄糖酸鹽，也可直接作為一種產品，用在乳品工業上防止乳石沉淀，用在食品配方中作為酸味劑，也用來配制家用或工廠用清洗劑(替代多磷酸鹽)、織物加工和金屬加工的助劑、皮革礬鞣劑、去藻劑、金屬除銹劑、建筑工業上混凝土的塑化劑、生物降解的螯合劑及二次采油的防沉淀劑等。葡萄糖酸的生產主要包括微生物發酵法、電解法和催化氧化法，其中微生物發酵法因其環境友好且能耗較低被廣泛采用，但也存在發酵時間長，發酵條件控制嚴格等問題。

葡萄糖脫氫酶(Glucosedehydrogenase，縮寫GlcDH)作為短鏈乙醇脫氫酶家族的一員，在輔因子NAD(P)+等存在時能夠快速地催化葡萄糖轉化為葡萄糖酸同時生成輔因子NAD(P)H。制備α-氨基丁酸過程所需的NADH可通過葡萄糖脫氫酶催化葡萄糖生成葡萄糖酸來獲取，α-氨基丁酸與葡萄糖酸的制備過程構建了一個NAD+與NADH的輔因子循環過程，可以達到高效聯產α-氨基丁酸與葡萄糖酸的目的。

發明內容

本發明的主要研究內容：本發明在于將不同來源的葡萄糖脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶 基因構建重組共表達載體pET-28a-Bsglcdh+Bcldh、pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh及pET-duet-Ppglcdh+Bsadh、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh，并將其轉化E.coli BL21，成功構建了基因工程菌pET-28a-Bsglcdh+Bcldh/BL21、pET-28a-Bsglcdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Bsadh/BL21、pET-duet-Ppglcdh+Scvdh/BL21。同時將L-蘇氨酸脫氨酶(ltd)基因利用分子技術進行克隆，構建重組表達載體pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并將其轉化E.coli BL21，成功構建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源輔因子的條件下，利用全細胞轉化法對廉價底物L-蘇氨酸及葡萄糖進行轉化高效聯產α-氨基丁酸和葡萄糖酸，為α-氨基丁酸及葡萄糖酸的應用提供了一種有效的策略。

本發明的技術方案：

1.引物的設計