[發(fā)明專利]一種高效聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸及葡萄糖酸的策略有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510814936.2 | 申請日： | 2015-11-23 |
| 公開（公告）號： | CN105255934B | 公開（公告）日： | 2019-02-22 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 饒志明;張冬竹;章暉;周俊平;楊套偉;張顯;徐美娟 | 申請（專利權(quán)）人： | 安徽華恒生物科技股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/70 | 分類號： | C12N15/70;C12P13/00;C12P7/58 |
| 代理公司： | 無錫華源專利商標(biāo)事務(wù)所(普通合伙) 32228 | 代理人： | 聶漢欽 |
| 地址： | 230000*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 氨基丁酸 葡萄糖酸 氨基酸脫氫酶 輔因子 聯(lián)產(chǎn) 葡萄糖脫氫酶 重組大腸桿菌 大腸桿菌 葡萄糖脫氫酶基因 蘇氨酸脫氨酶 循環(huán)再生系統(tǒng) 葡萄糖 共表達載體 基因工程菌 基因構(gòu)建 有效策略 共表達 蘇氨酸 底物 構(gòu)建 菌體 外源 轉(zhuǎn)化 發(fā)酵 串聯(lián) | ||
1.一種串聯(lián)葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶重組大腸桿菌用于聯(lián)產(chǎn)α-氨基丁酸和葡萄糖酸的方法，其特征在于包括以下內(nèi)容：
(1)重組菌的構(gòu)建
以染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR；采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度；采用相同的限制性內(nèi)切酶對載體pET-28a或者pET-Duet和純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收；將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入氨芐霉素或卡那霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
以pET-28a為葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的共表達載體時，以連上pET-28a的葡萄糖酸脫氫酶質(zhì)粒為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的帶啟動子的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR；采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度；采用相同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上L-氨基酸脫氫酶的載體pET-28a-ldh和純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收；將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
以pET-Duet為葡萄糖脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的共表達載體時；先以染色體DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行L-氨基酸脫氫酶的基因PCR，采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度；采用相同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上pET-Duet的葡萄糖脫氫酶質(zhì)粒載體和純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切以，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收；將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入氨芐霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于-40℃冰箱保存；
(2)使用重組大腸桿菌在LB培養(yǎng)基進行誘導(dǎo)培養(yǎng)，然后進行全細胞轉(zhuǎn)化：利用pH7.0的50mMPB緩沖液洗滌細胞然后將細胞重新懸浮于pH6.0-8.0的50mMPB緩沖液中，在不加入任何輔因子的情況下，加入1ML-蘇氨酸、1M葡萄糖及0.1-1v/v％的增加細胞通透性的表面活性劑，利用添加一定的化學(xué)試劑調(diào)節(jié)使轉(zhuǎn)化的pH保持在6.0-8.0之間，并控制轉(zhuǎn)化的溫度在30-42℃之間，制備得到α-氨基丁酸和葡萄糖酸；
所述的L-氨基酸脫氫酶選自：芽孢桿菌來源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來源的L-纈氨酸脫氫酶或紅球菌來源的L-苯丙氨酸脫氫酶；
所述的葡萄糖脫氫酶選自：芽孢桿菌來源的葡萄糖脫氫酶或假單胞菌來源的葡萄糖脫氫酶；
所述的增加細胞通透性的表面活性劑為：吐溫80、甲苯、曲拉通X100或十六烷基三甲基溴化銨CTAB。
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