[發(fā)明專利]一種苯并(a)芘酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510814308.4
• 申請日: 2015-11-23
• 公開（公告）號: CN105738611A
• 公開（公告）日: 2016-07-06
• 發(fā)明（設計）人: 許麗;張雪春;趙魯;程言君
• 申請（專利權(quán)）人: 輕工業(yè)環(huán)境保護研究所
• 主分類號: G01N33/53
• 分類號: G01N33/53;G01N21/31
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)，具體涉及一種用于檢測土壤和水中苯并(a)芘殘留的酶聯(lián)免疫試劑盒，其特別適用于生活飲用水，地下水，江河湖水，工業(yè)廢水等水樣和污染土壤中苯并(a)芘殘留的檢測。

技術(shù)背景

苯并(a)芘(Benzoapyrene，BaP)是含有5個苯環(huán)的多環(huán)芳烴，是多環(huán)芳烴中毒性最大的一種致癌物質(zhì)，在300到600℃之間的不完全燃燒狀態(tài)下產(chǎn)生。因此，苯并(a)芘成為世界各國所面臨的重大環(huán)境與公共健康問題之一。美國國家環(huán)保局(USEPA)將苯并(a)芘列為優(yōu)先控制污染物，對其進行嚴格的監(jiān)管和控制。我國地表水環(huán)境質(zhì)量標準(GB3838-2002)中嚴格規(guī)定了地表水中苯并(a)芘的濃度限量。

環(huán)境樣品中苯并(a)芘的監(jiān)測和分析主要包括以下幾個步驟：樣品采集，苯并(a)芘提取，凈化和濃縮，最后采用氣相色譜法或高效液相色譜法等儀器分析方法進行檢測。整個過程步驟繁瑣，耗時較長，儀器設備昂貴，不適合對大量樣品在短時間的分析和監(jiān)測。除以上兩種主要的儀器分析方法外，用于測定苯并(a)芘的方法還有熒光法和酶聯(lián)免疫吸附分析法。與其它方法相比，酶聯(lián)免疫吸附分析法應用于環(huán)境污染物的檢測分析在國外早有先例，并得到了國外環(huán)境保護部門的認可。酶聯(lián)免疫吸附分析法(Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay，ELISA)是將抗原-抗體的免疫反應和酶的高效催化反應有機結(jié)合形成的一種綜合性技術(shù)。同時具有特異性好，靈敏度高，操作簡便快捷，且可同時處理大批量樣品等憂點。因此，研究應用該方法對苯并(a)芘進行檢測分析越來越受到研究人員的關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有檢測苯并(a)芘的方法對設備的依賴性高，并且不能實現(xiàn)對大批量樣品的快速檢測的缺點，提供一種檢測環(huán)境中土壤和水中苯并(a)芘的酶聯(lián)免疫檢測試劑盒及其檢測方法，本發(fā)明不受檢測設備的限制并且能夠?qū)崿F(xiàn)對大批量的苯并(a)芘殘留樣品進行快速篩查。

本發(fā)明的另一目的在于提供一種檢測樣品中苯并(a)芘的快速、簡便的定性或定量的方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下測定原理：首先將苯并(a)芘抗原吸附于酶標板孔內(nèi)，然后加入待測樣品和人工制備的苯并(a)芘抗體，和酶標記的針對第一抗體的第二抗體(酶標二抗，若一抗為兔抗體，則酶標二抗為酶標羊抗兔IgG抗體；若一抗為鼠抗體，則酶標二抗為酶標羊抗鼠IgG抗體)，酶標板孔內(nèi)的抗原與樣品中的待測物相互競爭與加入的苯并(a)芘抗體結(jié)合，通過洗滌后，酶標板孔內(nèi)留下抗原-苯并(a)芘抗體一酶標二抗的結(jié)合物。洗去未結(jié)合的苯并(a)芘抗體和酶標二抗，再加入底物，酶催化底物反應而顯色。酶標板上固定的抗原及加入的一抗、酶標二抗的量是一定的，若樣品中待測物濃度較高，則與之結(jié)合所需的抗體量就較多，與載體上抗原結(jié)合的抗體量就相對較少，發(fā)色反應減弱，吸光度值降低；反之，則發(fā)色反應增強，吸光度值增高。因而，根據(jù)已知濃度的苯并(a)芘的標準曲線和待測樣品的吸光度，再根據(jù)吸光度與苯并(a)芘濃度之間的半對數(shù)關(guān)系作圖即得標準曲線，并推算出待測樣品中苯并(a)芘的濃度。

本發(fā)明上述目的可通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供的酶聯(lián)免疫試劑盒包括以下組分：

已包被苯并(a)芘抗原的酶標板

苯并(a)芘標準品溶液

苯并(a)芘抗體工作液

酶標二抗

抗體稀釋液

樣品稀釋液

顯色液

終止液

所述苯并(a)芘抗原由苯并(a)芘半抗原和載體蛋白通過活性脂法偶聯(lián)得到，所述載體蛋白為牛血清白蛋白，卵清白蛋白；所用的包被液為pH9.6，0.05M的碳酸鹽緩沖液，苯并(a)芘抗原的包被濃度為0.5～1μg/ml，封閉液優(yōu)選為含有2％BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS溶液)。所述PBS溶液濃度為0.01mol/L，pH值7.4，其中主要成分含量為KH₂PO₄0.2％，Na₂HPO₄3％，NaCl8％，KCl0.2％。

所述酶標板為96孔聚苯乙烯酶標板，包被有能與抗苯并(a)芘抗體特異性結(jié)合的苯并(a)芘抗原，并封閉微孔板表面未吸附苯并(a)芘抗原的位點。

所述特異性抗體為苯并(a)芘多克隆抗體或單克隆抗體中的一種，為本實驗室前期按常規(guī)免疫方法制備得到，收集腹水采用親和層析柱進行純化。

所述酶標二抗為辣根過氧化物酶標記的羊抗鼠或羊抗兔抗體。