[發明專利]一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201510805221.0
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105238813A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發明（設計）人: 丁莉萍;魏建華;王宏芝;陳亞娟;張杰偉;李瑞芬
• 申請（專利權）人: 北京農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李連生;李桂玲

技術領域

本發明屬于轉基因實驗方法領域，具體為一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法。

背景技術

共培養是植物轉基因實驗轉化過程中最為關鍵的一環。T-DNA的轉移及整合都在此時完成。農桿菌附著外植體后不能立即轉化，附著16h后才能誘發腫瘤經過“細胞調節期”，使T-DNA發生轉移。因此共培養時間較長。但共培養時間過長，也可能導致農桿菌過度增殖使植物細胞受到毒害而死亡。共培養中農桿菌的增殖速度直接與轉化有關，農桿菌增殖和生長狀態與其侵染能力相關。

農桿菌培養大多直接將外植體放在固體培養基上培養，由于常使用的培養基加入了大量元素、微量元素、蔗糖等物質（常用共培養基成份為：MS（大量，微量，有機，肌醇）+3%（W/V）蔗糖+200uMAS+0.7%（W/V）瓊脂粉），一是比較容易染菌；二是由于培養基含水量高，而且沒有濾紙，容易造成農桿菌過度生長，導致后期由于無法抑制過多農桿菌的生長使外植體褐化而死。根癌農桿菌侵染外植體時，既要使菌液和外植體充分接觸，T-DNA能轉移到植物細胞，又不能使外植體受到農桿菌毒害過大，導致后期由于無法抑制過多農桿菌的生長使外植體褐化而死。現有技術培養過程中大多因共培養過程操作不當導致轉化率低下甚至后續實驗無法進行。

發明內容

本發明的目的在于提供一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法可以保證外植體在共培養時間段內既不因失水而失去活力，也能保證農桿菌不過多的增殖。

一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，包括：1）農桿菌的活化、2）農桿菌侵染外植體、3）農桿菌與外植體共培養、4）外植體誘導和篩選分化，所述農桿菌與外植體共培養步驟的操作為：在固體共培養基上放置滅菌濾紙將農桿菌侵染后的外植體表面菌液吸凈后放置在所述滅菌濾紙上黑暗條件培養3~4天，培養溫度22~23℃。

進一步的，所述固體共培養基的制備方法為：蒸餾水加入0.7%（W/V）的瓊脂粉，高壓滅菌后加入200uM乙酰丁香酮。

進一步的，所述濾紙為WhatmanNo.1定性濾紙。

進一步的，所述農桿菌活化的具體操作為：取凍存農桿菌，在冰上融化后接種于5mlYEP液體培養基中，28℃，200rpm過夜振蕩培養；次日擴大培養于50ml的YEP液體培養基中，振蕩培養至OD₆₀₀=0.6-0.8，離心收集菌體，重懸于侵染培養液中，侵染前加入200μM乙酰丁香酮，得活化的農桿菌懸液。

進一步的，所述農桿菌侵染外植體的具體操作為：外植體與活化的農桿菌懸液混合，浸染時間為10~30min。

進一步的，所述外植體誘導和篩選分化過程的具體操作為：經過共培養后的外植體用附加200~300mg/LTimentin的無菌水清洗后，以無菌濾紙吸去殘留液體，于分化培養基上光照培養5-7天，轉移至選擇培養基上培養，待抗性芽長至1-2cm時轉至生根培養基上生根，所述分化培養、選擇培養、生根培養的條件：溫度25℃，光照14h/d，光照強度1600~2000lux。

進一步的，所述外植體誘導和篩選分化過程的具體操作為：經過共培養后的外植體用附加250mg/LTimentin的無菌水洗3-4遍，再用無菌濾紙吸去殘留液體，于誘導培養基上黑暗培養3-4周，然后轉移至選擇培養基上培養，待抗性芽長至1-2cm時轉至生根培養基上生根，所述誘導培養、選擇培養、生根培養的條件：溫度25℃，光照16h/d，光照強度1600~2000lux。

進一步的，所述外植體為葉片、葉柄、莖、幼胚、成熟胚。

進一步的，所述農桿菌菌株為EHA105、LBA4404、GV3101、AGL1。

本發明的有益效果：

1）培養基的滲透一直可以保持濕潤狀態，這樣既可以保證外植體在共培養時間段內不因失水而失去活力，也能保證農桿菌不過多的生長，使外植體和農桿菌充分接觸而不過度生長，從而可以提高轉化效率。

2）簡化共培養基配制，采用最簡單的培養成分滿足轉化的需要，即能保證培養基的濕潤度又可以減少共培養過程中的污染。

下面結合附圖及具體實施方式對本發明作進一步詳細說明。

附圖說明

圖1為兩種共培養方式瞬時表達結果比較。

具體實施方式

實施例1