[發明專利]一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法

在審

• 申請號: 201510805221.0
• 申請日: 2015-11-20
• 公開（公告）號: CN105238813A
• 公開（公告）日: 2016-01-13
• 發明（設計）人: 丁莉萍;魏建華;王宏芝;陳亞娟;張杰偉;李瑞芬
• 申請（專利權）人: 北京農業生物技術研究中心
• 主分類號: C12N15/84
• 分類號: C12N15/84;A01H5/00
• 代理公司: 北京國林貿知識產權代理有限公司 11001
• 代理人: 李連生;李桂玲

1.一種農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，包括：1）農桿菌的活化、2）農桿菌侵染外植體、3）農桿菌與外植體共培養、4）外植體誘導和篩選分化，其特征在于：所述農桿菌與外植體共培養步驟的操作為：在固體共培養基上放置滅菌濾紙將農桿菌侵染后的外植體表面菌液吸凈后放置在所述滅菌濾紙上黑暗培養3~4天，培養溫度22~23℃。

2.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述固體共培養基的制備方法為：蒸餾水加入0.7%的瓊脂粉，高壓滅菌后加入200uM乙酰丁香酮。

3.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述濾紙為WhatmanNo.1定性濾紙。

4.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述農桿菌活化的具體操作為：取凍存農桿菌，在冰上融化后接種于5mlYEP液體培養基中，28℃，200rpm過夜振蕩培養；次日擴大培養于50ml的YEP液體培養基中，振蕩培養至OD₆₀₀=0.6-0.8，離心收集菌體，重懸于侵染培養液中，侵染前加入200μM乙酰丁香酮，得活化的農桿菌懸液。

5.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述農桿菌侵染外植體的具體操作為：外植體與活化的農桿菌懸液混合，浸染時間為10~30min。

6.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述外植體誘導和篩選分化過程的具體操作為：經過共培養后的外植體用附加200~300mg/LTimentin的無菌水清洗后，以無菌濾紙吸去殘留液體，于分化培養基上光照培養5-7天，轉移至選擇培養基上培養，待抗性芽長至1-2cm時轉至生根培養基上生根，分化培養、選擇培養、生根培養的條件：溫度25℃，光照14h/d，光照強度1600~2000lux。

7.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述外植體誘導和篩選分化過程的具體操作為：經過共培養后的外植體用附加250mg/LTimentin的無菌水洗3-4遍，再用無菌濾紙吸去殘留液體，于誘導培養基上黑暗培養3-4周，然后轉移至選擇培養基上培養，待抗性芽長至1-2cm時轉至生根培養基上生根，所述誘導培養、選擇培養、生根培養的條件：溫度25℃，光照16h/d，光照強度1600~2000lux。

8.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述外植體為葉片、葉柄、莖、幼胚、成熟胚。

9.根據權利要求1所述的農桿菌介導外植體遺傳轉化方法，其特征在于：所述農桿菌菌株為EHA105、LBA4404、GV3101、AGL1。