[發明專利]鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針、以及其檢測方法

在審

• 申請號: 201510801925.0
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN105219882A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發明（設計）人: 李光;馬志遠
• 申請（專利權）人: 北京利德曼生化股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/325
• 代理公司: 北京風雅頌專利代理有限公司 11403
• 代理人: 王安娜;李翔

技術領域

本發明涉及分子生物學領域，特別是指一種鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針、以及其檢測方法。

背景技術

非結核分枝桿菌廣泛存在于自然界的土壤，塵埃，水，魚類和家禽中，傳播途徑主要從環境中獲得感染，例如污水，而人與人之間的傳染極少見。通常此類分枝桿菌對人類致病性較結核分枝桿菌低，但如果存在易感因素，使宿主局部或全身免疫功能發生障礙，則可導致病變。非結核分枝桿菌其中以鳥胞內分枝桿菌復合群(M.aviumcomplex)堪薩斯分枝桿菌(M.Kartsasii)和蟾蜍分枝桿菌(M.xenopi)為引起肺部病變的最常見致病菌。

鳥分枝桿菌病是由鳥-胞內分枝桿菌復合體(Mycobacteriumaviumcomplex或Mycobacteriumavium-intracellularecomplex,MAIC)感染引起的人獸共患性傳染病。MAIC感染后可侵害多種組織器官包括肺、骨髓和淋巴結等。臨床病癥主要包括單一的結節、結節狀的支氣管擴張、結節樣的浸潤和在免疫力低下患者中的擴散性浸潤四種類型。

目前，實驗室里鑒定分枝桿菌采用的方法為涂片法和培養法。涂片法不能將結核分枝桿菌和非結核分枝桿菌分開；培養法準確但需要培養2-3次才能確認，且耗時過長。近些年來也出現了一些針對鳥胞內分枝桿菌復合群的分子生物學鑒定方法，但也均需4-6個小時，如反向雜交，PCR-RFLP等，且容易出現實驗室污染。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提出一種鳥胞內分枝桿菌復合群檢測用引物和探針、以及其檢測方法。

基于上述目的本發明提供的用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物，包括用于檢測鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQIDNO.1和SEQIDNO.2；以及用于檢測胞內分枝桿菌的上游引物和下游引物，其核苷酸序列分別為序列表中的SEQIDNO.3和SEQIDNO.4。

由上述引物衍生的引物序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是指在SEQIDNO.1和/或SEQIDNO.2，以及SEQIDNO.3和/或SEQIDNO.4的基礎上經過一至十個堿基的取代、缺失或添加得到的引物序列。

基于相同的發明構思，本發明還提供了用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的Taqman探針，包括具有序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的兩個Taqman探針；兩個所述探針的5’端標記有報告熒光基團，3’端標記有淬滅熒光基團。

較佳的，所述具有序列表中SEQIDNO.5的探針的5’端標記JOE，3’端標記BHQ；所述具有序列表中SEQIDNO.6的探針的5’端標記FAM，3’端標記BHQ。

由上述Taqman探針序列的衍生序列也屬于本發明的保護范圍。所述衍生序列是在SEQIDNO.5和/或SEQIDNO.6的基礎上，在序列的5’端和/或3’端添加一個或多個堿基得到的序列。

基于相同的發明構思，本發明還提供了鳥胞內分枝桿菌復合群檢測試劑盒，包括用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物和Taqman探針。

基于相同的發明構思，本發明還提供了一種檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的方法，采用上述用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的引物和上述用于檢測鳥胞內分枝桿菌復合群的Taqman探針，以待檢測樣本基因組DNA為模板，進行熒光定量PCR，其步驟如下：

1)提取待檢測樣本基因組DNA；

2)配置熒光定量PCR反應體系：模板5μl，10×Taq酶buffer5μl，2.5mMdNTP4μl，用于檢測鳥分枝桿菌的上游引物和下游引物各2μl，其濃度均為10μM，用于檢測胞內分枝桿菌的上游引物和下游引物各2μl，濃度為10μM，序列表中SEQIDNO.5和SEQIDNO.6的兩個Taqman探針各1μl，濃度均為10μM，Taq酶2.5U，UNG酶0.01μl，ddH₂O補至50μl；

3)進行PCR反應：反應條件為：50℃2min；94℃5min；94℃30s，60℃40s，共40個循環；在熒光定量PCR儀上進行擴增，收集信號。