[發明專利]一種培養櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養基及方法

在審

• 申請號: 201510801587.0
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN105602887A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發明（設計）人: 張志峰;季愛昌;李學玉;秦貞奎;馬曉世;楊丹丹
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12R1/91
• 代理公司: 北京國智京通知識產權代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

技術領域

本發明屬于海洋貝類的細胞培養技術領域，具體涉及一種培養櫛 孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養基及方法。

背景技術

細胞培養是生物工程中的重要手段和常用方法之一，已廣泛應用 于染色體分析、細胞代謝、基因表達、免疫、癌變機制、病毒培養、 分離、鑒定和藥物篩選等研究領域。貝類組織培養工作從20世紀60 年代末期開始，已見報道的有牡蠣、貽貝、文蛤等十幾種。國內從 20世紀80年代開始進行該領域的研究。細胞培養是否成功的關鍵是 能否創造適宜的環境使體外細胞能夠持續增殖，目前還沒有一種針對 海洋貝類的細胞培養基，為了更好地使貝類細胞生長，許多研究者對 此進行了大量的添加因子等探索性研究。但由于海洋貝類細胞培養多 模仿哺乳動物細胞培養流程，培養基也是在哺乳動物細胞培養基的基 礎上做出改動，而海洋貝類細胞對營養的要求與哺乳動物細胞有所差 異，使得海洋貝類細胞生長和分裂缺乏適宜的營養因子。因此，雖然 經過了近半個世紀的努力，仍沒有建立起海洋貝類的永生性細胞系， 其細胞培養多停留在原代培養和有限細胞系水平上。許多研究者希望 通過添加因子優化培養基來建立海洋貝類細胞系。

另外，體外培養的細胞種類也至關重要，常見的細胞培養種類有 成體組織細胞，如鰓細胞、外套膜細胞、血細胞、心臟細胞、神經細 胞等，然而成體組織細胞在體外分裂增殖能力有限，因此并非理想的 細胞培養種類來源。發育早期的胚胎或幼蟲細胞通常具有更大的有絲 分裂潛能，并且細胞多處于低分化水平或者未分化的干細胞狀態，這 一特性使胚胎或幼蟲細胞成為細胞培養的最佳實驗材料。海洋貝類是 海洋生物中的重要類群，其胚胎外由于有膜包被不易獲得單細胞，因 此，幼蟲細胞是海洋貝類具有體外培養前景的細胞來源。櫛孔扇貝 (Chlamysfarreri)隸屬于軟體動物門(Mollusca)、瓣鰓綱 (Lamellibranchia)、珍珠貝目(Pterioida)、扇貝科(Pectinidae)、扇 貝屬(Pecten)，是僅產于我國北部沿海的經濟貝類，為我國北方重 要的養殖品種。

發明內容

本發明的目的在于提供一種用于培養櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系 的培養基及方法，旨在解決現有技術無法實現貝類細胞傳代培養的問 題。

本發明具體通過以下技術方案實現：

一種培養櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系的培養基，所述的培養基包括 以下組分：13.7g/l的L-15基礎培養基、20.2g/lNaCl、0.54g/lKCl、 0.60g/lCaCl₂、1g/lMgSO₄、3.9g/lMgCl₂及終濃度為5％的胎牛血清、 2mmol/L的谷氨酰胺、1％的櫛孔扇貝卵黃提取液、1％的櫛孔扇貝血 清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉素，pH為7.2-7.4。

本發明所述的櫛孔扇貝血清通過以下方法制備：于閉殼肌中抽取 櫛孔扇貝血淋巴，置于無菌容器中4℃靜置過夜，次日將上清液以 2000g離心10min，收集上清后分別經0.45μm和0.22μm孔徑的微 孔濾器過濾除菌，分裝后置于-20℃保存。

本發明所述的櫛孔扇貝卵黃提取液通過以下方法制備：解剖成熟 期的櫛孔扇貝卵巢，置于滅菌的海水中清洗3遍，用剪刀將卵巢剪碎 至乳糜狀；取1ml乳糜狀的組織到15ml離心管中，加入10ml無 鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液；冰上超聲破碎3min，功率200W；結束后 靜置5min，再4℃，8000g，離心1h；收集上清液經0.45μm、0.22 μm微孔過濾除菌后分裝到1.5ml離心管中，每管1ml，封膜，凍存 備用。

所述的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液通過以下方法配置：0.2g/l KCl、0.2g/lKH₂PO₄、30g/l、2.16g/lNa₂HPO₄·7H₂O的水溶液，使用 超純水作為溶劑，調節pH至7.2-7.4后高壓滅菌，置于4℃保存。

本發明的另一目的在于提供一種培養櫛孔扇貝擔輪幼蟲細胞系 的方法，利用所述培養基進行擔輪幼蟲的單細胞原代培養，實現早期 傳代并進行傳代培養，具體包括以下步驟：

1)單細胞的獲取