[發(fā)明專利]一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)基及方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510801587.0
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN105602887A
• 公開（公告）日: 2016-05-25
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張志峰;季愛昌;李學(xué)玉;秦貞奎;馬曉世;楊丹丹
• 申請（專利權(quán)）人: 中國海洋大學(xué)
• 主分類號: C12N5/07
• 分類號: C12N5/07;C12R1/91
• 代理公司: 北京國智京通知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11501
• 代理人: 孫文彬

1.一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的培養(yǎng)基，其特征在于， 所述的培養(yǎng)基包括以下組分：13.7g/l的L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基、20.2g/l NaCl、0.54g/lKCl、0.60g/lCaCl₂、1g/lMgSO₄、3.9g/lMgCl₂及終 濃度為5％的胎牛血清、2mmol/L的谷氨酰胺、1％的櫛孔扇貝卵黃提 取液、1％的櫛孔扇貝血清、100IU/ml的青霉素和100μg/ml的鏈霉 素，pH為7.2-7.4。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的 培養(yǎng)基，其特征在于，所述的櫛孔扇貝血清通過以下方法制備：于閉 殼肌中抽取櫛孔扇貝血淋巴，置于無菌容器中4℃靜置過夜，次日將 上清液以2000g離心10min，收集上清后分別經(jīng)0.45μm和0.22μm 孔徑的微孔濾器過濾除菌，分裝后置于-20℃保存。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的 培養(yǎng)基，其特征在于，所述的櫛孔扇貝卵黃提取液通過以下方法制備： 解剖成熟期的櫛孔扇貝卵巢，置于滅菌的海水中清洗3遍，用剪刀將 卵巢剪碎至乳糜狀；取1ml乳糜狀的組織到15ml離心管中，加入 10ml無鈣鎂離子磷酸鹽緩沖液；冰上超聲破碎3min，功率200W； 結(jié)束后靜置5min，再4℃，8000g，離心1h；收集上清液經(jīng)0.45μm、 0.22μm微孔過濾除菌后分裝到1.5ml離心管中，每管1ml，封膜， 凍存?zhèn)溆谩?

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的 培養(yǎng)基，其特征在于，所述的無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液通過以下方 法配置：0.2g/lKCl、0.2g/lKH₂PO₄、30g/l、2.16g/lNa₂HPO₄·7H₂O 的水溶液，使用超純水作為溶劑，調(diào)節(jié)pH至7.2-7.4后高壓滅菌，置 于4℃保存。

5.一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的方法，其特征在于，利 用權(quán)利要求1所述培養(yǎng)基進(jìn)行擔(dān)輪幼蟲的單細(xì)胞原代培養(yǎng)，實現(xiàn)早期 傳代并進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種培養(yǎng)櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系的 方法，其特征在于，

1)單細(xì)胞的獲取

取性腺成熟的櫛孔扇貝，誘導(dǎo)配子排放、人工授精并培養(yǎng)到擔(dān)輪 幼蟲，離心濃縮加入無鈣鎂離子的磷酸鹽緩沖液解離獲得擔(dān)輪幼蟲的 單細(xì)胞；

2)原代培養(yǎng)

將獲得的單細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿中，加入1ml權(quán)利要求1所述培 養(yǎng)基，啟動原代培養(yǎng)；

3)傳代培養(yǎng)

當(dāng)原代培養(yǎng)的細(xì)胞長出克隆后挑取克隆，實現(xiàn)早期傳代，待傳代 培養(yǎng)的細(xì)胞鋪瓶率達(dá)到80％時，使用機械吹打的方法以1：2的比例 進(jìn)行傳代，完成櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲體外培養(yǎng)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)，成功建 立櫛孔扇貝擔(dān)輪幼蟲細(xì)胞系。