[發明專利]牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法

在審

• 申請號: 201510801181.2
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN105567801A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發明（設計）人: 趙玉簪
• 申請（專利權）人: 英格爾檢測技術服務（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海三和萬國知識產權代理事務所(普通合伙) 31230
• 代理人: 陳偉勇

技術領域

本發明涉及食品檢測領域，具體涉及牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測方法。

背景技術

由于豬肉與牛肉、羊肉價格差別較大，近年來在經濟利益的驅動下，以豬肉添加牛肉香精、羊油、色素等添加劑冒充羊肉、牛肉及其制品的違法犯罪事件屢見不鮮。如浙江犯罪團伙用豬肉生產假牛肉干，一年多制造銷售達75噸；廣州思味食品的“億思”牌牛肉干以豬肉和牛肉膏為原料，以假充真，兩年銷售2000萬元；內蒙古不法分子豬肉冒充牛肉，添加牛肉香精，將生產的假風干牛肉銷往包頭周邊地區及陜西、寧夏等省市。這些事件損壞了消費者的利益，甚至危害消費者身體健康。而且因穆斯林忌食豬肉，這些假牛羊肉也涉及到民族和宗教問題。這些都嚴重動搖了消費者對食品行業的信心。

由于經過色素、香精加工的豬肉紋理、色澤和氣味與牛肉、羊肉相似，普通消費者難以辨別，深加工過的假牛肉干等制品更是難以分辨。目前肉類成分鑒定的方法主要是根據蛋白質成分和基因序列，如色譜、酶聯免疫反應(ELISA)和聚合酶鏈式反應(PCR)法。目前一些企業已經開發出豬肉蛋白質的ELISA檢測試劑盒和試劑條，但這些試劑盒和試劑條檢測準確性不高。實時熒光PCR(real-timePCR)方法具有靈敏度、準確性高的優點，同時不需要購買昂貴的試劑盒。目前肉類成分食品檢測標準主要基于實時熒光PCR方法，如SN/T3730.8-2013《食品及飼料中常見畜類品種的鑒定方法第8部分豬成分檢測實時熒光PCR法》。

但這些標準主要是對食品和飼料中豬、牛、雞等動物源成分進行定性檢測，不能進行定量檢測，無法依據陽性結果判斷是因為生產者故意摻假還是生產中污染造成。同時因為大部分檢測標準的目標基因是18SrRNA等多拷貝基因，檢測靈敏度非常高(可檢出0.001％特定動物源性成分)，容易出現假陽性結果。這些缺點限制使這些檢測標準無法作為判斷是否慘假的依據，因此急需一種準確快速的豬肉成分定量檢測方法作為肉類慘假判定的依據。

發明內容

本發明的目的在于，提供牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法。

本發明所解決的技術問題可以采用以下技術方案來實現：

牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，樣品預處理；

步驟二，DNA抽?。?

步驟三，DNA濃度和純度的測定；

步驟四，實時熒光PCR反應；

步驟五，結果計算。

本發明進行牛肉制品中豬肉成分含量定量檢測，檢測過程簡便，結果準確，并且提取的豬肉濃度參考物質DNA可以長時間保持，與購買商業試劑盒相比，成本低廉，滿足了豬肉摻假鑒定的需要。

所述步驟一中，所述樣品為干燥固體時，可直接以粉碎機研磨成細粉；所述樣品為濕狀時，經冷凍干燥處理后，再研磨成細粉備用。

作為一種方案，所述步驟二中，包括2-1：稱取兩個0.2g樣品試樣，至2ml離心管中，加入900μL預熱的CTAB裂解緩沖液和40μL蛋白酶K，輕輕混勻后，65℃水浴保溫30min；

2-2：12000g離心5min，取上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體積的酚，三氯甲烷和異戊醇的混合液(25:24:1)，震蕩混勻；

2-3：12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的三氯甲烷和異戊醇的混合液(24:1)，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清至干凈的2ml離心管中；

2-4：加入等體積異丙醇，顛倒混勻，12000g離心5min，棄去上清液；E.用4℃預冷的70％乙醇500μL，渦旋清洗沉淀，12000g離心5min，棄去上清液；

2-5：倒置曬干后加100μLRNA酶A緩沖液，37℃溫育30min；

2-6：重復步驟2-4、2-5，倒置曬干后加50μLTE緩沖液溶解沉淀，-20℃保存備用。

作為另一種方案，所述步驟二中，也可使用商品化DNA提取試劑盒提取DNA。

所述步驟三中，使用紫外分光光度計檢測提取的DNA的吸光值A260和A280，其A260/A280比值應在1.7～2.0之間，按以下公式計算DNA濃度：

C＝A*N*50

C—DNA濃度，單位為ng/μL；

A—260nm處的吸光值

N—DNA稀釋倍數

將DNA濃度稀釋到50ng/μL。