[發(fā)明專利]牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510801181.2
• 申請日: 2015-11-19
• 公開（公告）號: CN105567801A
• 公開（公告）日: 2016-05-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 趙玉簪
• 申請（專利權(quán)）人: 英格爾檢測技術(shù)服務(wù)（上海）有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68
• 代理公司: 上海三和萬國知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31230
• 代理人: 陳偉勇

1.牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一，樣品預(yù)處理；

步驟二，DNA抽取；

步驟三，DNA濃度和純度的測定；

步驟四，實(shí)時熒光PCR反應(yīng)；

步驟五，結(jié)果計(jì)算。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在 于，所述步驟一中，所述樣品為干燥固體時，直接以粉碎機(jī)研磨成細(xì)粉；所 述樣品為濕狀時，經(jīng)冷凍干燥處理后，再研磨成細(xì)粉備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在 于，所述步驟二中，包括2-1：稱取兩個0.2g樣品試樣，至2ml離心管中，加 入900μL預(yù)熱的CTAB裂解緩沖液和40μL蛋白酶K，輕輕混勻后，65℃水浴 保溫30min；

2-2：12000g離心5min，取上清于另一干凈的2ml離心管中，加入等體 積的酚，三氯甲烷和異戊醇的混合液，震蕩混勻；

2-3：12000g離心5min，取上清至干凈的2ml離心管中，加入等體積的 三氯甲烷和異戊醇的混合液，顛倒混勻，12000g離心10min，取上清至干凈 的2ml離心管中；

2-4：加入等體積異丙醇，顛倒混勻，12000g離心5min，棄去上清液； E.用4℃預(yù)冷的70％乙醇500μL，渦旋清洗沉淀，12000g離心5min，棄去上 清液；

2-5：倒置曬干后加100μLRNA酶A緩沖液，37℃溫育30min；

2-6：重復(fù)步驟2-4、2-5，倒置曬干后加50μLTE緩沖液溶解沉淀，-20℃ 保存?zhèn)溆谩?

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在 于，所述步驟二中，使用商品化DNA提取試劑盒提取DNA。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在 于，所述步驟三中，使用紫外分光光度計(jì)檢測提取的DNA的吸光值A(chǔ)260和 A280，其A260/A280比值應(yīng)在1.7～2.0之間，按以下公式計(jì)算DNA濃度：

C＝A*N*50

C—DNA濃度，單位為ng/μL；

A—260nm處的吸光值

N—DNA稀釋倍數(shù)

將DNA濃度稀釋到50ng/μL。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的牛肉制品中豬肉成分定量檢測方法，其特征在 于，所述步驟四中，還包括擴(kuò)增，擴(kuò)增時，應(yīng)設(shè)立兩個對照：陰性對照、空 白對照；每個反應(yīng)，各濃度參考物質(zhì)和樣品試樣需設(shè)置三個重復(fù)試驗(yàn)；分別 對豬特異性內(nèi)源基因和動物參照基因進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系如下：

2XTaqManUniversalPCRMasterMix………12.5μl

上游引物10μM…………………………………0.5μl

下游引物10μM…………………………………0.5μl

探針……………………………………………0.5μl

DNA模版…………………………………………2μl

ddH2O至總體積25μl

反應(yīng)管離心后放入熒光定量PCR儀，按下述反應(yīng)條件完成PCR擴(kuò)增：

預(yù)變性：95℃10min，1個循環(huán)；

PCR擴(kuò)增：95℃15sec；60℃60sec，40個循環(huán)。