[發明專利]利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法

有效

• 申請號: 201510790841.1
• 申請日: 2015-11-17
• 公開（公告）號: CN105602948B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 郭寶生;王凱輝;趙存鵬;李軍英;耿軍義;劉素恩;王兆曉;馬玉柱
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 石家莊元匯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13115
• 代理人: 張梅申

本發明公開了利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法，所述基因見序列表中的SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。鑒定步驟包括：①待測棉花品種營養缽培養室育苗；②黃萎病病菌培養；③浸根接種；④總RNA提取；⑤cDNA合成；⑥與陸地棉抗性相關關鍵基因和內參基因GhACTIN14的熒光定量PCR特異引物的合成；⑦熒光定量PCR檢測；⑧結果分析。本發明能夠在陸地棉品種6葉期就可鑒定其對黃萎病的抗性，鑒定結果可靠，準確率可達100％，并且操作簡便易行。

技術領域

本發明屬于棉花育種領域，涉及鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法，具體地說，涉及利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法。

背景技術

棉花黃萎病是由大麗輪枝菌引起的影響陸地棉品種最嚴重的病害之一，由于缺乏有效的化學防治藥劑，只有依賴棉花品種抗性的提高來減少產量損失，因此棉花品種抗黃萎病鑒定是培育抗黃萎病品種的必要手段。目前用于棉花品種黃萎病抗性鑒定方法主要有兩大類，一類是田間鑒定方法，如自然病圃鑒定和人工病圃鑒定；一類是室內苗期鑒定方法，如裸根蘸菌法、針刺接菌法、紙缽撕底法、無底塑缽菌液澆根法和毒素鑒定。

田間鑒定方法中人工病圃鑒定被認為是最接近自然實際，最為可靠的抗病鑒定方法，在抗病育種過程中應用最為普遍，但此鑒定方法受鑒定病圃限制，并易受氣候條件的影響，一般需要2-3年重復鑒定才能出結果，歷時太長。溫室病圃鑒定也需要半年左右的時間，鑒定時間長，不能做到早期診斷。

室內苗期鑒定方法目前應用最多的主要有紙缽撕底法、無底塑缽菌液澆根法等，但由于這些方法傷根程度很難做到統一，致使實驗產生誤差(簡桂良，2001.簡桂良,孫文姬,馬存.棉花黃萎病抗性鑒定新方法--無底塑缽菌液澆根法[J].棉花學報,2001,13(2):67-69.)。而針刺接菌法使黃萎病菌強制侵入到棉株維管束系統，違背了病菌在自然條件下的侵染規律，使棉花自身的部分防衛系統失效，不能客觀反映鑒定材料的抗性(史認輝.棉花抗黃萎病鑒定技術研究.華中農業大學碩士學位論文,2010))。毒素鑒定法，需要提取粗毒素，較繁瑣，且與上述方法相比，棉苗往往表現為發病偏重(杜威世，2003，杜威世.棉花黃萎病抗性遺傳及分子標記研究.[碩士學位論文〕.保定：河北農業大學圖書館，2003)。

郭寶生等(郭寶生,王凱輝,劉素恩,趙存鵬,耿軍義,張香云,華金平.陸地棉抗黃萎病種質創新與抗病基因挖掘.棉花學報,2014,26(3):252-259.)研究表明，陸地棉植株受到黃萎病菌侵染后，植株內部會形成物理障礙或生化障礙來遏制棉花黃萎病菌在體內擴展，但是由于不同品種的抗病基因表達調控水平不一，從而出現抗病差異。與黃萎病抗性相關基因主要有植物抗毒素合成相關基因、植株組織結構防御蛋白相關基因等。這種黃萎病菌侵染下不同陸地棉品種抗病相關基因的表達差異可以通過熒光定量PCR技術進行檢測((郭寶生，師恭曜，等，黃萎病菌侵染下棉花Dirigent-like蛋白基因表達差異分析.中國農業科學,2014,47(22):4349-4359.)。熒光定量PCR技術(Bustin S A，Benes V，Nolan T，Pfaffl M W.Quantitative real-time RT-PCR-A perspective.Journal of MolecularEndocrinology，2005,34:597-601.)是通過熒光染料或熒光標記的特異性探針，對PCR產物進行標記跟蹤，實時監控反應過程。隨著PCR反應的進行，反應產物不斷累積，熒光信號強度也等比例增加。每經過一個循環，收集一次熒光強度信號，這樣就可以通過熒光強度變化監測產物量的變化。

發明內容