[發明專利]利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的基因及方法

有效

• 申請號: 201510790841.1
• 申請日: 2015-11-17
• 公開（公告）號: CN105602948B
• 公開（公告）日: 2018-10-30
• 發明（設計）人: 郭寶生;王凱輝;趙存鵬;李軍英;耿軍義;劉素恩;王兆曉;馬玉柱
• 申請（專利權）人: 河北省農林科學院棉花研究所
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12Q1/6895;C12Q1/686
• 代理公司: 石家莊元匯專利代理事務所(特殊普通合伙) 13115
• 代理人: 張梅申

1.陸地棉品種抗黃萎病鑒定相關基因，其特征在于包括序列表中SEQ ID NO：1所示的多向耐毒性基因和SEQ ID NO：2所示的轉錄子基因。

2.陸地棉品種抗黃萎病鑒定相關基因的PCR擴增特異引物，其特征在于多向耐毒性基因的特異引物上游序列見SEQ ID NO：3，下游序列見SEQ ID NO：4；轉錄子基因特異引物上游序列見SEQ ID NO：5，下游序列見SEQ ID NO：6。

3.利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于包括如下步驟：①待測棉花品種營養缽培養室育苗；②黃萎病病菌培養；③病菌浸根接種：用步驟②培養的病菌菌液對步驟①育成的幼苗進行浸根接種；④總RNA提取：摘取步驟③中被病菌侵染過的幼苗嫩片，提取葉片總RNA；⑤cDNA合成；⑥與陸地棉抗性相關關鍵基因即SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示基因，以及內參基因GhACTIN14的熒光定量PCR特異引物的合成；⑦熒光定量PCR檢測；⑧結果分析。

4.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟①所述的待測棉花品種營養缽培養室育苗采用塑料周轉箱內紙質營養缽培養室育苗，培養條件：平均溫度28℃，每天保持光照14個小時。

5.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟③所述的病菌浸根接種，是指當待測棉花品種幼苗長至6葉期開始進行病菌浸根接種，病菌孢子濃度為10^6-10⁸個/ml的孢子懸浮液。

6.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟④所述的總RNA提取，提取的是病菌接種侵染0h和48h時的幼苗嫩片中的總RNA。

7.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟⑤所述的cDNA合成反應體系為步驟④中提取的總RNA 2μl，Anchored oligo(dT)18 primer濃度為0.5μg/μl，1μl，2×TS Reaction Mix 10μl，Transcript RT/R1Enzyme Mix 1μl，gDNA Remover 1μl，Rnase-free water 5μl。

8.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟⑥所述的與陸地棉抗性相關關鍵基因和內參基因GhACTIN14的的熒光定量PCR特異引物的合成，合成引物GC含量50％，Tm在60℃-62℃，長度18-22個核苷酸，擴增片段80-150bp；合成的序列表中SEQ ID NO：1所示基因特異引物序列：上游序列見SEQ ID NO：3，下游序列見SEQ ID NO：4；合成的序列表中SEQ ID NO：2所示基因特異引物序列：上游序列見SEQ ID NO：5，下游序列見SEQ ID NO：6；合成的內參基因GhACTIN14特異引物序列：上游序列見SEQ ID NO：7，下游序列見SEQ ID NO：8。

9.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟⑦所述的熒光定量PCR檢測，反應體系為Premix Ex Taq TM 10μl，步驟⑥中合成的相應被檢測基因的特異上游引物濃度為10pm/μl，0.4μl，下游引物濃度為10pm/μl，0.4μl，ROX Reference Dye 0.4μl，滅菌蒸餾水7.8μl，cDNA 2μl；RT-PCR反應程序：預變性95℃，30s；95℃，5s，60℃，34s，40個循環。

10.根據權利要求3所述的利用熒光定量PCR技術鑒定陸地棉品種抗黃萎病的方法，其特征在于步驟⑧結果分析所依據的檢測標準是，利用熒光定量PCR數據采用相對定量2^-ΔΔCt法，在接種黃萎病菌后48h序列表中SEQ ID NO：1所示基因相對表達量倍值大于2和序列表中SEQ ID NO：2所示基因相對表達量倍值小于1的判定為抗病品種；在接種黃萎病菌后48h序列表中SEQ ID NO：1所示基因相對表達量倍值小于1和序列表中SEQ ID NO：2所示基因相對表達量倍值大于2的判定為感病品種。