[發明專利]一種區分蠶絲種類的檢測方法

有效

• 申請號: 201510769490.6
• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN105424943B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 游秋實;王秉;萬軍民;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司33241
• 代理人: 周豪靖

技術領域

本發明涉及一種區分蠶絲種類的檢測方法，主要用于古代絲織品的檢測。

背景技術

蠶絲是古代漢族文明產物之一,至今仍是我國的寶貴資源。我國出產的蠶絲有兩種，一種是通常所說的桑蠶絲，就是栽桑養家蠶結的繭里抽出的蠶絲，這種蠶絲色澤白里略帶黃色，手感細膩、光滑，有一股淡淡的動物纖維特有的氣味。另一種蠶絲就是柞蠶絲，它是用柞蠶繭抽絲出來的。柞蠶俗稱野蠶，主要生活在北方地區，它由人工放養在野外柞林之中，以柞葉為食。和桑蠶絲相比，柞蠶絲的顏色比較深，纖維較粗，其本色為黑灰色，一般經過漂白后制成成品。在蠶絲起源以及養殖研究領域，迫切需要科學嚴謹的檢測手段。因為桑蠶絲柞蠶絲元素含量相似、僅存在氨基酸組成和結構差異；并且蠶絲作為一種有機高分子材料，長期處于墓葬或遺址環境中，必然會受到多種因素影響而出現蠶絲蛋白質發生降解及大分子鏈的斷裂等問題。所以用常規的檢測方法會出現樣品前處理困難，耗時長，靈敏度低及其它蛋白質的干擾等問題。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：針對上述問題提供一種簡單快捷、靈敏度高的蠶絲檢測方法，利用不同特征多肽制備蠶絲素蛋白特異抗體來在間接酶聯免疫的方法中檢測不同種類蠶絲的絲素蛋白成分，即將蠶絲素蛋白洗脫液包被到酶標記板上，然后添加兔抗絲素蛋白抗體與抗原結合形成抗原抗體復合物，洗滌后加入堿性磷酸酯酶標山羊抗兔IgG(H+L)抗體，形成抗體-抗原-抗體復合物，洗滌加入TMB顯色液，底物被酶催化為有色產物，根據產物顏色變化的深淺可進行定性分析。

為解決上述技術問題，為此采用如下的技術方案；一種區分蠶絲種類的檢測方法，根據桑蠶絲素蛋白和柞蠶絲素蛋白的氨基酸序列區別設計合成序列為“MQRKNKNHGILGKC”的多肽作為桑蠶絲素蛋白特異抗體，設計合成序列為“CSHSHSYEASRISVH”的多肽作為柞蠶絲素蛋白特異抗體。

一種區分蠶絲種類的檢測方法，具體包括如下步驟：

a)溶液的配制：PBS7.4緩沖液配制：KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.27g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖溶液配制：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃2.9g，用蒸餾水定容至1000ml；

封閉液(含質量分數1％BSA)配制：BSA0.1g，加PBS7.4緩沖液定容至10mL；

底物顯色液配制：TMB底物溶液與底物緩沖液以1：1體積混合；

終止液(2mol/LH₂SO₄)配制：蒸餾水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL；

b)將0.01g-0.1g文物樣溶解于100-1000mL PH為9.6的碳酸鹽緩沖溶液中，混合攪拌均勻，靜置，取50-120μl上清液加入到酶標記板中，形成實驗對照1、2；實驗對照1在后續步驟添加兔抗桑蠶絲素蛋白抗體，實驗對照2在后續步驟添加兔抗柞蠶絲素蛋白抗體；取50-120μl PH為7.4的PBS緩沖溶液作為空白對照1、2(空白對照與實驗對照相對應)用；陰性對照設為不加一抗，其包被液和實驗對照設為一樣；然后將各陰性對照，空白對照,實驗對照各放置于4℃冰箱中過夜；

c)各孔中加入封閉液100-300μl，37℃下封閉1-2h，然后吸出孔內液體，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

d)分別取用封閉液稀釋1000-12000倍的兔抗桑蠶和柞蠶絲素蛋白多克隆抗體50-120μl，加入到酶標記板中，保鮮膜封板，37℃下溫育1-2h，然后吸出孔內液體，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

e)各孔中加入用封閉液稀釋3000-10000倍的磷酸酯酶山羊抗兔IgG(H+L)抗體50-120μl，37℃下溫育1-2h，然后吸出孔內液體，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌5次，每次3min；

f)各孔內加底物顯色液100μl，置黑暗處使其反應10min；

g)各孔內加終止液50-120μl，終止反應；

h)將酶標記板置于酶標儀中讀取吸光度數值；

i)比較實驗組測得的OD值；

將空白對照的OD均值+3個SD作為cut-off值；