[發明專利]一種區分蠶絲種類的檢測方法

有效

• 申請號: 201510769490.6
• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN105424943B
• 公開（公告）日: 2017-07-28
• 發明（設計）人: 游秋實;王秉;萬軍民;胡智文
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司33241
• 代理人: 周豪靖

1.一種區分蠶絲種類的檢測方法,其特征在于利用不同特征多肽制備蠶絲素蛋白特異抗體來在間接酶聯免疫的方法中檢測不同種類蠶絲的絲素蛋白成分，即將蠶絲素蛋白洗脫液包被到酶標板上，然后添加兔抗絲素蛋白抗體與抗原結合形成抗原抗體復合物，洗滌后加入堿性磷酸酯酶標記山羊抗兔IgG抗體，洗滌加入底物顯色液，底物被酶催化為有色產物，根據產物顏色變化的深淺可進行定性分析；

其中，根據桑蠶絲素蛋白和柞蠶絲素蛋白的氨基酸序列區別設計合成序列為“MQRKNKNHGILGKC”的多肽制備桑蠶絲素蛋白特異抗體，設計合成序列為“CSHSHSYEASRISVH”的多肽制備柞蠶絲素蛋白特異抗體；

具體檢測步驟如下：

a)溶液的配制：pH為7.4的PBS緩沖液配制：KCl 0.2g，KH₂PO₄ 0.27g，NaCl 8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O 3.58g，用蒸餾水定容至1000mL；碳酸鹽緩沖溶液配制：Na₂CO₃ 1.5g，NaHCO₃2.9g，用蒸餾水定容至1000ml；

封閉液配制：BSA0.1g，加pH為7.4的PBS緩沖液定容至10mL；

終止液配制：蒸餾水178.90mL，逐滴加入98％硫酸21.70mL；

b)將0.01g-0.1g樣品溶解于100-1000mL pH為9.6的碳酸鹽緩沖溶液中，混合攪拌均勻，靜置，取50-120μl上清液加入到酶標板中，形成實驗對照1、2；實驗對照1在后續步驟添加兔抗桑蠶絲素蛋白抗體，實驗對照2在后續步驟添加兔抗柞蠶絲素蛋白抗體；取50-120μl pH為7.4的PBS緩沖溶液作為空白對照1、2用，空白對照與實驗對照相對應；陰性對照設為不加一抗，其包被液和實驗對照設為一樣；然后將各陰性對照，空白對照,實驗對照各放置于4℃冰箱中過夜；

c)各孔中加入封閉液100-300μl，37℃下封閉1-2h，然后吸出孔內液體，用pH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

d)分別取用封閉液稀釋1000-12000倍的兔抗桑蠶和柞蠶絲素蛋白多克隆抗體50-120μl，加入到酶標板中，保鮮膜封板，37℃下溫育1-2h，然后吸出孔內液體，用pH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

e)各孔中加入用封閉液稀釋3000-10000倍的堿性磷酸酯酶標記山羊抗兔IgG抗體50-120μl，37℃下溫育1-2h，然后吸出孔內液體，用pH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌5次，每次3min；

f)各孔內加底物顯色液100μl，置黑暗處使其反應10min；

g)各孔內加終止液50-120μl，終止反應；

h)將酶標板置于酶標儀中，讀取吸光度數值；

i)比較實驗組測得的OD值；

將空白對照的OD均值+3個SD作為cut-off值；

若實驗對照1的OD均值＞空白對照1的cut-off值，則證明所檢測的樣品為桑蠶絲；

若實驗對照2的OD均值＞空白對照2的cut-off值，則證明所檢測的樣品為柞蠶絲。