[發明專利]一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法

在審

• 申請號: 201510767327.6
• 申請日: 2015-11-11
• 公開（公告）號: CN105256071A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 汪開毓;歐陽萍;陳俊杰;周立新;王定國;耿毅;陳德芳;尹立子;曹成易
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

技術領域

本發明涉及魚類病毒的快速檢測方法，具體涉及一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，尤其是采用非致死性方法采集樣品后提取DNA進行LAMP反應檢測的方法。

背景技術

錦鯉皰疹病毒病(KoiHerpesvirusDisease，KHVD)是由錦鯉皰疹病毒(KoiHerpesvirus，KHV)感染引起鯉魚、錦鯉以及普通變種鰓壞死、間質性腎炎的一種高致病性，高傳染性，高死亡率的疾病。該病發病率高、流行范圍廣，致死率高達80％-100％。自1998年以來，KHVD在世界范圍內許多鯉魚和錦鯉養殖場發生，死亡率極高，該病的爆發給鯉魚和錦鯉養殖業造成了嚴重的經濟損失。KHVD是OIE(Worldorganizationforanimalhealth)和中國農業部必須要求上報的Ⅱ類動物疫病

目前KHV的檢測診斷方法有細胞分離法、電鏡觀察法、中和實驗、ELISA、PCR、組織病理學觀察。聚合酶鏈式反應(PCR)和細胞培養技術是OIE推薦的診斷方法。《一種錦鯉皰疹病毒LAMP檢測試劑盒及檢測方法》中采用的是致死性采樣方法，采樣步驟繁瑣，不適用于活體檢測價值昂貴的觀賞性錦鯉，并且LAMP擴增反應液的添加復雜，易發生污染，在野外臨床檢測中存在各種限制，比如儀器、技術等方面。

因此需要設計一種新的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，以解決現有技術的問題。

發明內容

本發明的目的在于克服現有技術中的缺陷，設計一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，在引物設計方面選取了特異性和穩定性很高的Sphi區域作為目的條帶設計引物；使用非致死性的拭子采樣，操作快速簡單；采用了快速DNA提取方法，只需煮沸組織樣，靜置冷卻取上清即可完成，具有快速、簡便的特點；引入一對環狀引物，進一步縮短了反應時間；反應體系由LAMPmix和模板DNA兩部分組成，操作簡單，減少了假陽性；具有極高的檢測準確性和效率，不會對采樣活體帶來傷害，具有極佳的應用前景。

為實現上述目的，本發明所采用的技術方案是一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，所述方法通過設計鯉皰疹病毒III型Sphi基因編碼區域的特異性擴增引物，采用非致死性方法對鯉魚采樣后提取樣品DNA進行LAMP反應，通過對擴增產物的檢測，從而確定樣品中是否存在鯉皰疹病毒III型。

優選的，特異性擴增引物包括以下引物：

(1)上游內部引物(ForwardInnerPrimer，FIP)：

5’-GCTGTGGTAGGTGTTGCTGAGATTTTCACCACATCTGCAAGGAGT-3’

(2)上游外部引物(ForwardOuterPrimer，F3):

5’-GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3’

(3)下游內部引物(BackwardInnerPrimer，BIP):

5’-GAGCATCGTGGGGTTCCAGACTTTTAGGCTCTTGTAGCGGTCC-3’

(4)下游外部引物(BackwardOuterPrimer，B3):

5’-TGAACGACTGCGACTGTTG-3’

(5)上游環引物(ForwardLOOPPrimer，LF)：

5’-CAGCTTGTTCGAGC-3’

(6)下游環引物(BackwardLOOPPrimer，LB)：

5’-ATGGACCTCGCATACGC-3’。

優選的，提取樣品DNA中采用的DNA提取液包含以下成分：

10mmol·L^-1Tris-HCl，1mmol·L^-1EDTA，15mmol·L^-1氯化鈉，0.5％SDS，pH8.0。

優選的，LAMP擴增體系中，每25ul的LAMP擴增體系包含以下成分：

23ulLAMPmix，2ul模板DNA；

其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游內部引物FIP(50μM)，1μL下游內部引物BIP(50μM)，1uL下游環引物LB(25uM)，1uL上游環引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl₂(25mM)和2.5μLddH₂O；