[發明專利]一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法

在審

• 申請號: 201510767327.6
• 申請日: 2015-11-11
• 公開（公告）號: CN105256071A
• 公開（公告）日: 2016-01-20
• 發明（設計）人: 汪開毓;歐陽萍;陳俊杰;周立新;王定國;耿毅;陳德芳;尹立子;曹成易
• 申請（專利權）人: 四川農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/68
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 裴娜

1.一種快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，所述方法通過設計鯉皰疹病毒III型Sphi基因編碼區域的特異性擴增引物，采用非致死性方法采樣后提取樣品DNA進行LAMP反應，通過對擴增產物的檢測，從而確定樣品中是否存在鯉皰疹病毒III型。

2.如權利要求1所述的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，特異性擴增引物包括以下引物：

(1)上游內部引物(ForwardInnerPrimer，FIP)：

5’-GCTGTGGTAGGTGTTGCTGAGATTTTCACCACATCTGCAAGGAGT-3’

(2)上游外部引物(ForwardOuterPrimer，F3):

5’-GCTGTTTGCCTGCAGGAA-3’

(3)下游內部引物(BackwardInnerPrimer，BIP):

5’-GAGCATCGTGGGGTTCCAGACTTTTAGGCTCTTGTAGCGGTCC-3’

(4)下游外部引物(BackwardOuterPrimer，B3):

5’-TGAACGACTGCGACTGTTG-3’

(5)上游環引物(ForwardLOOPPrimer，LF)：

5’-CAGCTTGTTCGAGC-3’

(6)下游環引物(BackwardLOOPPrimer，LB)：

5’-ATGGACCTCGCATACGC-3’。

3.如權利要求1所述的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，提取樣品DNA中采用的DNA提取液包含以下成分：

10mmol·L^-1Tris-HCl，1mmol·L^-1EDTA，15mmol·L^-1氯化鈉，0.5％SDS，pH8.0。

4.如權利要求1所述的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，LAMP擴增體系中，每25ul的LAMP擴增體系包含以下成分：

23ulLAMPmix，2ul模板DNA；

其中23ulLAMPmix包含：1μL上游外部引物F3(10μM)，1μL下游外部引物B3(10μM)，1μL上游內部引物FIP(50μM)，1μL下游內部引物BIP(50μM)，1uL下游環引物LB(25uM)，1uL上游環引物LF(25uM)，3.5μLdNTPs(25mM)，3μL10×Thermopolbuffer，8UBstDNA聚合酶，3μLBetaine(8μM)，3μLMgCl₂(25mM)和2.5μLddH₂O；

其中1×Thermopolbuffer反應緩沖液包含：20mMTris-HCl、10mM(NH₄)₂SO₄、10mMKCl、2mMMgSO₄、0.1％TritonX-100(pH8.8，25℃)。

5.如權利要求1-4任一所述的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，該方法的步驟為：

(1)非致死性樣品采集：

使用采樣拭子或醫用棉簽采取魚兩側鰓部的黏液，將采完病料的拭子或棉簽置于保存管中保存備用；

(2)樣品DNA的提取：

取50ul裂解液于1.5mlEP管中，將采樣后的拭子或棉簽置于其中攪動1min，煮沸10分鐘后室溫靜置5分鐘，取上清液于-20℃保存備用；

或者用ViralDNAKit試劑盒按照說明書提取DNA，最后溶于30μL滅菌水，于-20℃保存備用；

(3)環介導等溫擴增LAMP：

采用25ul反應體系：23ulLAMPmix和2μL模板DNA；

反應程序為：64℃孵育60min，80℃用滅活酶處理5min終止反應；

(4)檢測結果判定：檢測步驟(3)制備的反應產物，如果存在環介導等溫擴增產物則說明待檢測魚中有鯉皰疹病毒III型。

6.如權利要求5所述的快速檢測鯉皰疹病毒III型的方法，其特征在于，檢測結果判定的方式為：發生擴增反應時，從dNTPs析出的焦磷酸根離子和反應液中鎂離子形成白色焦磷酸鎂沉淀，通過肉眼判斷：檢測管中出現明顯渾濁為陽性，未見渾濁為陰性。