[發明專利]一種古代羊毛織品中角蛋白的檢測方法

在審

• 申請號: 201510767286.0
• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN105353118A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 劉楊;王秉;游秋實
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 周豪靖

技術領域

本發明涉及一種羊毛織品中角蛋白的檢測方法，主要用于古代羊毛織品的檢測。

背景技術

古代在北方地區毛織品廣泛應用于服飾和毛毯，而羊毛織物占絕大多數。出土的大量毛織物其精美程度不亞于出土的絲綢文物，這不僅是古代紡織技術演變的重要實物證據，也對研究古代社會環境和人文活動具有重要參考價值。而現有技術中缺乏對古代絲織品中羊毛角蛋白鑒定的深入研究。

羊毛角蛋白是一種硬化，不易溶解的蛋白質，其中既有含羧基等在內的酸性基，也有含胺基，亞胺基等在內的堿性基，所以在酸、堿、鹽、氧化劑、還原劑、鹵素等中羊毛都具有一定的不穩定性。在絲織品文物鑒定中，這對羊毛制品的鑒別造成了一定困難。而Elisa法鑒定羊毛絲織品快捷，方便，能高效準確鑒別出羊毛織品，從而為古代羊毛織品發展研究提供依據。

發明內容

本發明目的是要克服上述現有技術中存在的不足，而提供一種利用間接酶聯免疫的方法來檢測古代羊毛織品中羊毛角蛋白的成分，即將羊毛織品文物洗脫液包被到酶標板上，然后添加兔抗角蛋白抗體和抗原形成抗原抗體復合物，洗滌后加入堿性磷酸酯酶標山羊抗兔lgG（H+L）抗體，形成抗體-抗原-抗體復合物，然后洗滌加入TMB顯色液，底物被酶催化為有色產物，根據產物顏色變化深淺進行定性分析。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種古代羊毛織品中角蛋白的檢測方法，它包括如下步驟：

1）羊毛角蛋白的提取：

稱取6%的過硫酸氫鉀（OXONE），加水溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調節溶液pH3.5-5；以1:50的浴比取羊毛纖維試樣放入溶液中，30℃下水浴鍋震蕩60min；取出羊毛纖維試樣后蒸餾水水洗過濾3-5次，至水洗液pH值為7；洗凈的羊毛纖維試樣加入到5%wt的亞硫酸氫鈉、6M尿素、1%wt的十二烷基苯磺酸鈉的混合溶液中，在100℃下反應4h，后過濾，得到清澈的角蛋白溶液，溶液裝入透析袋中，截留分子量14000，去離子水透析4-5天，直至透析袋中的溶液透明澄清，得到純凈角蛋白溶液，冷凍干燥后獲得絮狀角蛋白粉末；

2）溶液配制：

PBS7.4緩沖液配制：KCl0.2g，KH₂PO₄0.27g，NaCl8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，用蒸餾水定容至1000mL；

PBS9.6緩沖溶液配制：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，用蒸餾水定容至1000ml；

封閉液（含質量分數1%BSA）配制：BSA0.1g，加PBS7.4緩沖液定容至10mL；

底物顯色液配制：TMB底物溶液與底物緩沖液以1：1體積混合；

終止液（2mol/LH2SO4）配制：蒸餾水178.90mL，逐滴加入98%硫酸21.70mL；

3）將0.001g-0.01g角蛋白粉和0.01g-0.1g文物樣分別溶解于100-1000mlPH為9.6的PBS緩沖溶液中，混合攪拌均勻，靜置，分別取50-120μl上清液加入到酶標板中，形成陽性對照和實驗對照；取50-120μlPH為7.4的PBS緩沖溶液作為空白對照用；陰性對照為不加兔抗角蛋白一抗，其包被液和陽性對照設為一樣；然后將各陰性對照，陽性對照，實驗對照各放置于4℃冰箱中過夜；

4）各孔中加入封閉液100-300μl；37℃下封閉1-2h然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

5）取用封閉液稀釋1000-12000倍的兔抗角蛋白抗體50-120μl加入到酶標板中，保

鮮膜封板，37℃下孵育1h；然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3

次，每次3min；

6）各孔中加入3000倍稀釋的磷酸酯酶山羊抗兔IgG（H+L）抗體50-120μl；37℃下孵育1h；然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌5次，每次3min；

7）各孔內加底物顯色液100μl，置黑暗處使其反應10min；

8）各孔內加終止液50-120μl，終止反應；

9）將酶標板置于酶標儀中，讀取λ=450nm處的吸光度數值；比較陽性對照，陰性對照與實驗對照測得的OD值；

若OD實驗對照/OD陰性對照＞2.1，則證明所檢測的樣品呈現陽性，說明實驗對照中存在角蛋白；