[發明專利]一種古代羊毛織品中角蛋白的檢測方法

在審

• 申請號: 201510767286.0
• 申請日: 2015-11-12
• 公開（公告）號: CN105353118A
• 公開（公告）日: 2016-02-24
• 發明（設計）人: 劉楊;王秉;游秋實
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/535
• 分類號: G01N33/535
• 代理公司: 杭州斯可睿專利事務所有限公司 33241
• 代理人: 周豪靖

1.一種古代羊毛織品中角蛋白的檢測方法，其特征在于利用間接酶聯免疫的方法來檢測古代羊毛織品中角蛋白成分，即將羊毛織品文物洗脫液包被到酶標板上，然后添加兔抗角蛋白抗體和抗原形成抗原抗體復合物；洗滌后加入堿性磷酸酯酶標山羊抗兔lgG（H+L）抗體，形成抗體-抗原-抗體復合物，洗滌加入TMB顯色液，底物被酶催化為有色產物，根據產物顏色變化深淺進行定性分析。

2.根據權利要求1所述的古代羊毛織品中角蛋白的檢測方法，其特征在于它包括如下步驟：

1）羊毛角蛋白的提取：

稱取6%的過硫酸氫鉀（OXONE），加水溶解，用飽和氫氧化鈉溶液調節溶液pH3.5-5；以1:50的浴比取羊毛纖維試樣放入溶液中，30℃下水浴鍋震蕩60min；取出羊毛纖維試樣后蒸餾水水洗過濾3-5次，至水洗液pH值為7；洗凈的羊毛纖維試樣加入到5%wt的亞硫酸氫鈉、6M尿素、1%wt的十二烷基苯磺酸鈉的混合溶液中，在100℃下反應4h，后過濾，得到清澈的角蛋白溶液，溶液裝入透析袋中，截留分子量14000，去離子水透析4-5天，直至透析袋中的溶液透明澄清，得到純凈角蛋白溶液，冷凍干燥后獲得絮狀角蛋白粉末；

2）溶液配制：

PBS7.4緩沖液配制：KCl0.2g，KH₂PO₄0.27g，NaCl8.0g，Na₂HPO₄·12H₂O3.58g，用蒸餾水定容至1000mL；

PBS9.6緩沖溶液配制：Na₂CO₃1.5g，NaHCO₃2.9g，用蒸餾水定容至1000ml；

封閉液（含質量分數1%BSA）配制：BSA0.1g，加PBS7.4緩沖液定容至10mL；

底物顯色液配制：TMB底物溶液與底物緩沖液以1：1體積混合；

終止液（2mol/LH2SO4）配制：蒸餾水178.90mL，逐滴加入98%硫酸21.70mL；

3）將0.001g-0.01g角蛋白粉和0.01g-0.1g文物樣分別溶解于100-1000mlPH為9.6的PBS緩沖溶液中，混合攪拌均勻，靜置，分別取50-120μl上清液加入到酶標板中，形成陽性對照和實驗對照；取50-120μlPH為7.4的PBS緩沖溶液作為空白對照用；陰性對照為不加兔抗角蛋白一抗，其包被液和陽性對照設為一樣；然后將各陰性對照，陽性對照，實驗對照各放置于4℃冰箱中過夜；

4）各孔中加入封閉液100-300μl；37℃下封閉1-2h然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3次，每次3min；

5）取用封閉液稀釋1000-12000倍的兔抗角蛋白抗體50-120μl加入到酶標板中，保

鮮膜封板，37℃下孵育1h；然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌3

次，每次3min；

6）各孔中加入3000-10000倍稀釋的磷酸酯酶山羊抗兔IgG（H+L）抗體50-120μl；37℃下孵育1h；然后將溶液吸出，用PH為7.4的PBS緩沖溶液洗滌5次，每次3min；

7）各孔內加底物顯色液100μl，置黑暗處使其反應10min；

8）各孔內加終止液50-120μl，終止反應；

9）將酶標板置于酶標儀中，讀取λ=450nm處的吸光度數值；比較陽性對照，陰性對照與實驗對照測得的OD值；

若OD實驗對照/OD陰性對照＞2.1，則證明所檢測的樣品呈現陽性，說明實驗對照中存在角蛋白；

若OD實驗對照/OD陰性對照≤2.1，則證明所測得的樣品呈現陰性，說明實驗對照中不存在角蛋白。