[發(fā)明專利]一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒制備方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201510760112.1 | 申請日： | 2014-04-18 |
| 公開（公告）號： | CN105301255A | 公開（公告）日： | 2016-02-03 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 芮雙印 | 申請（專利權(quán)）人： | 安徽大千生物工程有限公司 |
| 主分類號： | G01N33/577 | 分類號： | G01N33/577;G01N21/82 |
| 代理公司： | 合肥市上嘉專利代理事務(wù)所(普通合伙) 34125 | 代理人： | 王偉 |
| 地址： | 230031 安徽省合肥*** | 國省代碼： | 安徽;34 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 測定 人體 膽酸 含量 試劑盒 制備 方法 | ||
1.一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒的制備方法，其特征在于包括如下步驟：
一、甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的制備：
1)準確稱取2mg甘膽酸，將其溶解在100μlDMF試劑中，所得溶液為A液；用DMF配制89.4mg/mL的NHS溶液，所的溶液為B液；用DMF配制60.2mg/mL的二環(huán)己基碳二亞胺溶液，所得溶液為C液；稱取16mg血藍蛋白，將其溶解在1mLpH7.2、濃度0.02mol/L磷酸鹽緩沖液中；所得溶液為D液；
2)分別取B液和C液各30.7μL加到100μlA液中，室溫下攪拌90min；
3)將攪拌完畢的混合液加到D液中，在4℃條件下攪拌12h；
4)將步驟3)處理的反應(yīng)液放入pH7.4、濃度0.01mol/L磷酸鹽緩沖液中透析12h，即得到甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物；
二、甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒制備:
1)以步驟一所得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物皮下免疫小鼠；選擇免疫后血清效價大于10000的小鼠脾臟細胞與SP2/0骨髓瘤細胞進行融合，通過BSA-CG板篩選得到甘膽酸單克隆細胞抗體；
2)把1.5g膠乳顆粒加入150mlPH5.5、濃度80mmol/L的2-嗎啉代乙磺酸緩沖液中，攪拌30分鐘；然后添加0.067mg/ml的碳化二亞胺20ml以及0.033mg/ml的N羥基琥珀酰亞胺20ml，常溫反應(yīng)45分鐘；
3)把經(jīng)步驟2)反應(yīng)后的混合物，以15000轉(zhuǎn)/mim離心15分鐘，去上清液，然后用150mlPH8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得到膠乳顆粒混懸液；
4)將所得的膠乳顆粒混懸液重復(fù)步驟3)，重復(fù)后所得到的膠乳顆粒混懸液進行清洗；清洗后，用濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至700ml；
5)將180mg甘膽酸單克隆細胞抗體加入到300mlPH8.2、0.1mol/L磷酸緩沖液中，攪拌均勻；加入到步驟4)的膠乳溶液中；然后置于37度的搖床中，反應(yīng)2-4個小時；再加入0.5g/ml甘氨酸10ml，再次反應(yīng)30分鐘；
6)步驟5)反應(yīng)結(jié)束后，將5g牛血清白蛋白加到上述混合液中，攪拌均勻后，室溫放置12h；然后9000轉(zhuǎn)/mim離心15分鐘，去上清液，用500mlPH8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；得膠乳顆粒混懸液；
7)將所得到的膠乳顆粒混懸液再經(jīng)9000轉(zhuǎn)/mim離心15分鐘，去上清液，用500mlPH8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液重懸；將再次重懸后所得的膠乳顆粒混懸液用PH8.2、濃度0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液把體積調(diào)整至1000ml；所得溶液即為甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒；
三、甘膽酸R1試劑的制備
將步驟一制備獲得的甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物與緩沖液充分混合即得甘膽酸R1試劑，所述緩沖液為濃度10-100mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液的pH值為7-8；所述緩沖液中含有濃度2-6wt％的PEG-6000、0.7-0.9wt％的氯化鈉、0.05-0.1wt％的疊氮鈉、0.3wt％的PC-300、0.1-1wt％牛血清白蛋白以及20mMEDTA；所述甘膽酸R1試劑中甘膽酸-蛋白偶聯(lián)物的濃度為0.05-2mg/mL；
四、甘膽酸R2試劑的制備
將步驟二制備獲得的甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒與懸浮緩沖液混合即得甘膽酸R2試劑，所述懸浮緩沖液為含有穩(wěn)定劑和防腐劑的濃度為20-100mM的甘氨酸-Na0H緩沖液；所述穩(wěn)定劑由終濃度0.1-1.0wt％的牛血清白蛋白、0.7-0.9wt％的氯化鈉、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉、體積濃度0.1-1.0％TX-100組成；所述防腐劑為PC-300，終體積濃度為0.05-0.1％；所述甘膽酸R2試劑中甘膽酸-蛋白抗體包被的膠乳顆粒的質(zhì)量濃度為0.05-1.0％。
五、甘膽酸校準品的制備
向緩沖液中加入不同量的人源性甘膽酸得到濃度分別為0、2.5、5、10、20、40、80ug/ml的一組校準品；所述緩沖液為濃度0-200mM的Tirs-HCl溶液，所述緩沖液中含有終濃度0.1-1wt％的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt％的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二鈉。
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