[發明專利]一種測定人體甘膽酸含量的試劑盒制備方法

有效

• 申請號: 201510760112.1
• 申請日: 2014-04-18
• 公開（公告）號: CN105301255A
• 公開（公告）日: 2016-02-03
• 發明（設計）人: 芮雙印
• 申請（專利權）人: 安徽大千生物工程有限公司
• 主分類號: G01N33/577
• 分類號: G01N33/577;G01N21/82
• 代理公司: 合肥市上嘉專利代理事務所(普通合伙) 34125
• 代理人: 王偉

技術領域

本發明涉及生物化學技術領域，具體涉及一種采用免疫競爭法、膠乳增強比濁法測定人體中甘膽酸(CG)含量的試劑及其制備方法。

背景技術

血清甘膽酸(Cholyglycine,CG)是膽酸與甘氨酸結合二次的結合型膽酸之一，在肝細胞內，膽固醇經過及其復雜的酶促反應，轉變成初級膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去氧膽酸(CD-CA)。膽酸的類固醇核上有三個羥基(C3、C7、C12)，側鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨酸結合，CG由肝細胞合成，經毛細膽管、膽管排入膽囊，隨同膽汁進入十二指腸，幫助食物消化。95％膽酸在回腸末端重吸收，經門靜脈再回肝臟，由肝細胞攝取再利用。在血清中主要以蛋白結合形式存在。正常情況下，外周血中膽酸含量甚微，正常成人無論空腹或餐后，其血清CG濃度穩定在低水平。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量增高。測定血清甘膽酸(CG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。另外孕婦在懷孕的中后期，由于嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發生障礙而導致甘膽酸偏高，另外由于妊娠期胎盤合成和分泌大量雌激素和孕激素以及代謝負荷增大，可誘發肝膽系統的變化，使孕婦易患妊娠肝內膽汁淤積癥(ICP)，對胎兒產生嚴重的影響，隨ICP患者血清CG增高使羊水污染率、早產率、胎兒宮內窘迫率及剖宮產率增高，嚴重者可導致嬰兒的死亡，因此測定孕婦血清甘膽酸，對及早發現ICP和了解ICP的嚴重程度有著非常重要的意義，甘膽酸的測定可作為篩查和隨訪ICP的指標。從而降低圍產兒病死率。甘膽酸是肝臟分泌到膽汁中最大量的有機酸，進入腸腔幫助脂肪消化吸收，在回腸和結腸大部分被重吸收，經門靜脈入肝臟。肝細胞能高效能地從門靜脈攝取大量的甘膽酸，以致血液中的甘膽酸量小于1.9g/ml。重吸收的甘膽酸又進入肝腸循環，通過這種機制，機體能充分利用甘膽酸。一旦肝細胞病變，血中的甘膽酸濃度升高，其中急性肝炎、慢性肝炎輕度升高，肝硬變，肝癌病人顯著升高。當肝細胞受損時，肝細胞攝取CG能力下降，致使血中CG含量增高；膽汁郁滯時，肝臟排泄膽酸發生障礙，而返流血液循環的CG含量增高，也使血CG含量增高。因此，測定血清甘膽酸(CG)是評價肝細胞功能及其肝膽系物質循環功能的敏感指標之一。

目前已知的甘膽酸測定方法有放射免疫法(RIA)、化學發光法、酶聯免疫吸附法(ELISA)法、膠乳增強比濁法等，放射免疫分析法步驟繁瑣，試劑價格昂貴，需使用配套的儀器且存在放射性污染。酶聯免疫吸附法存在檢測時間長、操作復雜、重復性差、不適于急診和臨床病人及時診斷的需要。現有膠乳增強免疫比濁法雖然操作簡單、快速、但是靈敏度低，低值重復性差。

發明內容

本發明為了避免現有技術存在的不足之處，提供一種能夠應用到全自動化生化分析儀器上甘膽酸(CG)試劑盒及其制備方法。該試劑能夠快速、準確的檢測人血漿樣本中的甘膽酸含量。

本發明通過用偶聯在蛋白上的甘膽酸包被膠乳顆粒并懸浮在特定緩沖液中制作R2試劑。由于甘膽酸分子量非常小，只有一個抗原位點，不能制成膠乳試劑，抗原與抗體的反應不能形成膠聯而產生濁度，只能讓甘膽酸首先通過化學鍵偶聯在大分子蛋白上，形成多個位點，而分子量較大的蛋白可以更好的與膠乳顆粒結合，偶聯有甘膽酸的蛋白濃度為0.1-2.0mg/mL。偶聯有甘膽酸的蛋白進一步通過化學交聯方法包被在膠乳顆粒表面。

本發明通過在特定緩沖液中加入甘膽酸-蛋白偶聯物制作R1試劑，特定緩沖液中要添加無機鹽、促凝劑、蛋白質和防腐劑。所選擇的甘膽酸-蛋白復合體首先要通過間接ELISA方法檢測,確認不會產生非特異性反應。其中要求緩沖液的緩沖能力為調節pH范圍在7-9之間，可以選擇各種緩沖液，優選HEPES、甘氨酸、Tris等，與其他緩沖液相比，上述緩沖液具有緩沖能力強、溶解度高、很好的生物適應性和反應。其中Tris-HCl能較長時間控制恒定的pH范圍，因此更優選Tirs-HCl，其濃度范圍為10-100mM，pH范圍為7-8。促凝劑選擇PEG-6000，可以加快免疫反應速度，縮短檢測時間，其終濃度為2-6％。蛋白質選擇牛血清白蛋白，終濃度為0.1-1％。氯化鈉濃度為0.7-0.9％，疊氮鈉濃度為0.05-0.1％。