[發明專利]人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201510749897.2
• 申請日: 2015-11-06
• 公開（公告）號: CN105316285A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發明（設計）人: 曾憲卓;魯菲
• 申請（專利權）人: 深圳愛生再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

獲取骨髓間充質干細胞，采用三維細胞培養支架于培養基中進行體外培養；

其中，所述三維細胞培養支架是由膠原和殼聚糖，或膠原和賴氨酸制成；或，所述三維細胞培養支架是由膠原與殼聚糖和戊二醛三者共同制成的。

2.根據權利要求1所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，所述三維細胞培養支架中還添加有納米晶膠原基骨或脫細胞軟骨。

3.根據權利要求1所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，由所述膠原和殼聚糖制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中，配制膠原溶脹液；將殼聚糖溶于乙酸中，配制殼聚糖溶液，然后將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合脫泡，冷凍并凍干。

4.根據權利要求1所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，由所述膠原和賴氨酸制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中制成膠原溶脹液，經真空脫泡，冷凍并凍干處理后，浸泡于含有賴氨酸的MES溶液中，然后再添加EDAC交聯劑和含NHS氨基酸保護劑，交聯處理后漂洗，然后冷凍并干燥。

5.根據權利要求1所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，由所述膠原、殼聚糖和戊二醛制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中，配制成膠原溶脹液；并用乙酸溶液配制殼聚糖溶液，然后將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合并放置于真空中干熱交聯后浸泡于戊二醛溶液中，繼續交聯8-16個小時后，漂洗，冷凍并凍干。

6.根據權利要求1所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，獲取骨髓間充質干細胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細胞，PBS緩沖液離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質干細胞。

7.根據權利要求6所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，獲取骨髓間充質干細胞的步驟還包括對原代骨髓間充質干細胞進行傳代培養的過程，包括以下步驟：

將原代骨髓間充質干細胞濃度調整至1×10⁶～1×10⁸個/25ml，加入所述培養基進行培養；當細胞生長到融合時，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，見胞質回縮，細胞間隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培養基終止消化，按1：2～1：3比例接種進行傳代培養至細胞生長到融合，繼續傳代至獲得第三代骨髓間充質干細胞。

8.根據權利要求7所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，采用三維細胞培養支架進行體外培養的步驟為：取三維細胞培養支架復溶，取第三代骨髓間充質干細胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰個/L細胞濃度與復溶后三維細胞培養支架共同接種于所述培養基中進行培養。

9.根據權利要求4所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，三維細胞培養支架復溶過程中，還添加有助溶劑，且所述助溶劑的質量分數為5％-15％。

10.根據權利要求8所述的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，其特征在于，所述培養基為血清培養基，且所述血清培養基中添加有10^-6～10^-8mol/L的氫化可的松、80-120U/ml的青霉素及80-120mg/ml的鏈霉素。