[發明專利]人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法

有效

• 申請號: 201510749897.2
• 申請日: 2015-11-06
• 公開（公告）號: CN105316285A
• 公開（公告）日: 2016-02-10
• 發明（設計）人: 曾憲卓;魯菲
• 申請（專利權）人: 深圳愛生再生醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

技術領域

本發明涉及細胞工程技術領域，特別涉及一種人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法。

背景技術

骨髓間充質干細胞(Mesenchymaistemcells，MSCs)，是在骨髓中的一種類似成纖維細胞的一類細胞，具有多方向分化潛能，可以向骨組織、軟骨組織、皮膚、造血干細胞支持介質、骨骼肌細胞及心肌細胞轉化。自體骨髓間充質干細胞還具有取材方便、無免疫原性、具有多向分化潛能、合乎倫理學要求并且無致瘤性，具有其它干細胞不可比擬的優勢，因此，探討MSCs體外大量擴增具有深遠意義。

目前骨髓間充質干細胞的體外擴增多采用二維培養方式進行的，也有部分采用三維細胞培養支架進行培養，但均是采用單一的三維細胞培養支架，由于單一的三維細胞培養支架存在機械性能弱，不穩固等問題，因此，在培養過程中，容易從三維細胞培養支架的三維培養方式轉變成二維培養方式，從而使得骨髓間充質干細胞活性差，擴增不明顯。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，針對現有技術中采用單一的三維支架培養骨髓間充質干細胞的方法因支架機械性能弱，不穩固等造成骨髓間充質干細胞擴增率不高、細胞活性差等缺陷，提供一種能夠采用兩種及以上三維支架的人工模擬骨髓微環境進行骨髓間充質干細胞的培養方法。

本發明解決其技術問題所采用的技術方案是：提供一種人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法，包括以下步驟：

獲取骨髓間充質干細胞，采用三維細胞培養支架于培養基中進行體外培養；

其中，所述三維細胞培養支架是由膠原和殼聚糖，或膠原和賴氨酸組合制成；或，所述三維細胞培養支架是由膠原與殼聚糖和戊二醛三者共同制成的。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，所述三維細胞培養支架中還添加有納米晶膠原基骨或脫細胞軟骨。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，由所述膠原和殼聚糖制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中，配制膠原溶脹液；將殼聚糖溶于乙酸中，配制殼聚糖溶液，然后將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合脫泡，冷凍并凍干。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，由所述膠原和賴氨酸制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中制成膠原溶脹液，經真空脫泡，冷凍并凍干處理后，浸泡于含有賴氨酸的MES溶液中，然后再添加EDAC交聯劑和含NHS氨基酸保護劑，交聯處理后漂洗，然后冷凍并干燥。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，由所述膠原、殼聚糖和戊二醛制備三維細胞培養支架的過程包括以下步驟：

將膠原溶于乙酸溶液中，配制成膠原溶脹液；并用乙酸溶液配制殼聚糖溶液，然后將膠原溶脹液和殼聚糖溶液混合并放置于真空中干熱交聯后浸泡于戊二醛溶液中，繼續交聯8-16個小時后，漂洗，冷凍并凍干。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，獲取骨髓間充質干細胞的步驟包括：采集骨髓，肝素抗凝，在percoll分離液中離心，取中層單核細胞，PBS緩沖液離心洗滌，棄上清液，即收獲原代骨髓間充質干細胞。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，獲取骨髓間充質干細胞的步驟還包括對原代骨髓間充質干細胞進行傳代培養的過程，包括以下步驟：

將原代骨髓間充質干細胞濃度調整至1×10⁶～1×10⁸個/25ml，加入所述培養基進行培養；當細胞生長到融合時，PBS漂洗，加入胰蛋白酶，見胞質回縮，細胞間隙增大后，加入含胎牛血清的DMEM培養基終止消化，按1：2～1：3比例接種進行傳代培養至細胞生長到融合，繼續傳代至獲得第三代骨髓間充質干細胞。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，采用三維細胞培養支架進行體外培養的步驟為：取三維細胞培養支架復溶，取第三代骨髓間充質干細胞，PBS清洗，胰酶-EDTA消化，以1×10⁸～1×10¹⁰個/L細胞濃度與復溶后三維細胞培養支架共同接種于所述培養基中進行培養。

在本發明提供的人工模擬骨髓微環境培養骨髓間充質干細胞的方法中，三維細胞培養支架復溶過程中，還添加有助溶劑，且所述助溶劑的質量分數為5％-15％。