[發(fā)明專(zhuān)利]一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201510748468.3
• 申請(qǐng)日: 2015-11-07
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN105330737A
• 公開(kāi)（公告）日: 2016-02-17
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉乃山;林曉磊;劉翠珍
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 青島康原藥業(yè)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C07K14/81
• 分類(lèi)號(hào): C07K14/81;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/30;C07K1/22;C07K1/18;C07K1/16;A61K38/57
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技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)涉及一種低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾制備收率高、效價(jià)穩(wěn)定、低病毒的烏司他丁的制備方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物。

背景技術(shù)

烏司他丁（ULinastatin）系從健康成年男性新鮮尿液中分離純化出來(lái)的一種酸性糖蛋白，是一種廣譜的蛋白酶抑制劑，主要在肝臟中合成，由腎臟代謝隨尿液排出，且其分解形成的低分子量成分也具有很強(qiáng)的抑制水解酶的作用。烏司他丁由143個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量約37000~43000，屬于蛋白酶抑制劑，對(duì)胰蛋白酶、α-糜蛋白酶等絲氨酸蛋白酶及粒細(xì)胞彈性蛋白酶、透明質(zhì)酸酶、巰基酶、纖溶酶等多種酶有抑制作用，還具有穩(wěn)定溶酶體膜、抑制溶酶體酶的釋放、抑制心肌抑制因子（MDF）產(chǎn)生、清除氧自由基及抑制炎癥介質(zhì)釋放的作用。烏司他丁還可改善手術(shù)刺激引起的免疫功能下降、蛋白代謝異常和腎功能降低，防止手術(shù)刺激引起的對(duì)內(nèi)臟器官與細(xì)胞的損傷以及改善休克時(shí)的循環(huán)狀態(tài)等。

1909年歐洲首先報(bào)道人體尿液存在著胰蛋白酶抑制劑，隨后人們發(fā)現(xiàn)，當(dāng)人體受到感染、發(fā)熱、腫瘤、妊娠、休克、手術(shù)、給予糖皮質(zhì)激素等刺激時(shí)，人體尿液中UTI活性升高。1985年由日本首先開(kāi)發(fā)上市，在日本已作為急性胰腺炎、急性循環(huán)衰竭的治療藥物被廣泛應(yīng)用于臨床。

本發(fā)明人自2008年開(kāi)始對(duì)UTI的生產(chǎn)工藝進(jìn)行試驗(yàn)研究，采用現(xiàn)代蛋白質(zhì)高端生化分離技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)，使UTI的總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%。近期我們組織相關(guān)人員進(jìn)行科研攻關(guān)，最終采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來(lái)純化烏司他丁，病毒去除率不低于4log，生產(chǎn)工藝穩(wěn)定，質(zhì)量可控。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供了一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物，是為了攻克高嶺土吸附、耐酸性混合模式吸附等傳統(tǒng)方法提取烏司他丁收率過(guò)低、效價(jià)不高不穩(wěn)定、病毒指標(biāo)不明的缺點(diǎn)，采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來(lái)純化烏司他丁，從而提高了烏司他丁的收率，保證了效價(jià)的穩(wěn)定及用藥安全性。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種病毒滅活去除純化烏司他丁的方法及提高烏司他丁復(fù)溶性的藥物組合物，其特征在于：選用采用低溫乙醇沉淀、低PH法結(jié)合切向流超濾來(lái)純化烏司他丁，可以使總收率提高到70%以上，總效價(jià)不低于5000iu/mg，柱效提高約50%，病毒去除率不低于4log。

該技術(shù)方案中，其技術(shù)特征還在于所述方法包括如下步驟：

1）烏司他丁粗加工

稱(chēng)取1TpH小于6.5的澄清尿液，不斷攪拌，緩慢加入16.5kg甲殼質(zhì)吸附完全后用氨水洗脫，再經(jīng)過(guò)3.5kg硫酸銨鹽析，過(guò)夜沉淀、離心后置于用五氧化二磷作吸水劑的真空干燥器中真空干燥，干燥后即得烏司他丁粗品。

2）吸附柱層析（以0.25LDEAE樹(shù)脂柱為例）

2.1）將柱中的DEAE樹(shù)脂用純化水反沖下來(lái)，裝入桶中，用純化水浸沒(méi)攪勻，靜置，反復(fù)多次，純化水浸沒(méi)過(guò)夜；

2.2）將DEAE樹(shù)脂濾干，用少量純化水洗滌，再次濾干后裝入桶中，用0.5mol/L鹽酸浸沒(méi)，攪拌，過(guò)濾，用純化水洗至中性，再用0.5mol/LNaOH溶液浸泡，攪拌，過(guò)濾，再用純化水洗至中性；

2.3）將上述經(jīng)處理過(guò)的DEAE樹(shù)脂加洗脫液A反復(fù)平衡到pH6.5后，再用洗脫液A浸泡待用；

2.4）將上述平衡好的樹(shù)脂裝入柱內(nèi)，柱裝好后，再用洗脫液A走柱；

2.5）稱(chēng)取烏司他丁粗品1kg，用洗脫液A溶解，攪拌30分鐘，離心20分鐘，留取離心液，在60℃水浴攪拌加熱10小時(shí)；

2.6）將上述離心液流經(jīng)平衡好的DEAE樹(shù)脂柱，流速控制在120~130mL/min左右；

2.7）用洗脫液B溶液洗脫，流速控制在120~130mL/min，得洗脫液；

2.8）將洗脫液經(jīng)超濾膜，超濾至其體積的二十分之一，得超濾液約1.65L。

3）親和層析（以0.25L柱體為例）

3.1）用洗脫液C平衡親和層析柱，將超濾液流經(jīng)平衡過(guò)的樹(shù)脂柱，流速控制在120~130mL/min；

3.2）上樣結(jié)束后，用洗脫液C洗脫，流速120~130mL/min左右，收集洗脫液；

3.3）柱中的親和樹(shù)脂經(jīng)洗脫液C洗脫后，用洗脫液D洗滌去除吸附在上面的雜質(zhì)，流速控制在120~130mL/min，密封待用；