[發明專利]可避免假陰性的沙門氏菌恒溫熒光檢測引物組、試劑盒及檢測方法在審

申請號：	201510739814.1	申請日：	2015-11-02
公開（公告）號：	CN105219870A	公開（公告）日：	2016-01-06
發明（設計）人：	曹東林;胡亮杉;林茂銳;石磊;周旋;鐘麗梅;方曉琳;陳洵;唐大運;張璜;申洪杰;雷達;張知洪;田軍章	申請（專利權）人：	廣東省第二人民醫院;廣州迪澳生物科技有限公司
主分類號：	C12Q1/68	分類號：	C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42
代理公司：	廣州市深研專利事務所 44229	代理人：	姜若天
地址：	510317 廣東***	國省代碼：	廣東;44
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摘要：
搜索關鍵詞：	避免陰性沙門氏菌恒溫熒光檢測引物試劑盒方法
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【說明書】：

技術領域

本發明屬于分子生物學檢測技術領域，具體涉及一種沙門氏菌的恒溫檢測引物組、試劑盒及檢測方法。

背景技術

沙門氏菌（salmonella）是一種常見的人獸共患病原菌，不僅引起各種動物疾病，而且與人類多種疾病有關，其中，由沙門氏菌引起的食物中毒病例在食物中毒中居于前列。沙門氏菌屬的成員可感染多種動物和人，大部分具有很強的致病性。沙門氏菌感染因其對人類、畜禽飼養業造成的危害，而被廣泛重視。

目前，包括我國在內的許多國家對沙門氏菌的檢測普遍采用傳統培養方法，報告檢驗結果大致需4～5天，加之檢測方法繁瑣、費時費力，不僅成為檢驗部門的一項沉重負擔，而且越來越不能滿足日益發展的國際貿易的需要。20世紀50年代以來，為了尋求快速、準確、簡便、微量的檢測方法，國內外學者進行了大量的研究，從以傳統方法為基礎發展到以免疫學為基礎的或以分子生物學為基礎的快速檢測方法，并在實踐檢驗中不斷取得新進展。

以抗體為基礎的ELISA方法和免疫熒光標記方法將檢測時間縮短了一半，靈敏性高和但特異性差；以核酸為基礎的PCR技術及恒溫擴增技術由于靈敏、簡單、快速和特異已被廣泛用于沙門氏菌檢測。但檢測樣品復雜，因目前檢測方法對假陰性的檢測結果沒有采取監控手段，故存在漏檢的可能，但沙門氏菌危害嚴重，漏檢造成的危害無法估量，此外，PCR擴增需要昂貴的儀器，很多基層檢測單位不具備相應檢測條件。因此，建立一種可鑒別假陰性檢測結果的快速、高通量且對儀器要求不高的沙門氏菌檢測試劑盒及檢測方法成為目前急需解決的問題。恒溫擴增技術具有檢測時間短，易于操作等優點，本發明在恒溫擴增技術基礎上加入內標基因，可提供一種有效鑒別檢測結果為假陰性檢測方法，有利于食品中沙門氏菌的準確、及時發現，更加有利于恒溫檢測方法在檢測中的推廣應用及提高檢測的準確度。

本發明在樣品管檢測的時候同時設立一個內標基因檢測管，該內標檢測管及檢測方法具有以下特點：1）內標基因與實際樣品的檢測不在同一管中進行檢測，2）該內標基因的擴增靶標與樣品檢測管中的擴增靶標不同，3）內標基因的擴增靶標的核酸濃度在該內標基因的檢測線附近，可識別輕微的反應抑制。正常情況下因內標檢測管在加入樣品提取液的同時加入有低濃度的內標靶標片段，所以內標檢測管檢測檢測結果為陽性，如內標管檢測結果為陰性，提示樣品提取液中含有抑制因子或其他原因，導致內標檢測管不能進行擴增反應，同樣樣品檢測管也可能因抑制因子或其他原因導致不能進行正常擴增檢測，造成樣品檢測管檢測結果為假陰性，因此該方法可根據內標管的檢測結果輔助判斷樣品檢測結果可能為假陰性結果。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種用于檢測沙門氏菌的恒溫熒光引物組合物。

本發明的另一個目的在于提供一種沙門氏菌的恒溫熒光檢測試劑盒。

本發明的另一個目的在于提供一種沙門氏菌的恒溫熒光檢測方法。

本發明所采取的技術方案是：

用于檢測沙門氏菌的恒溫熒光檢測引物組合物，其包含一組檢測引物和一組內標引物，其中，所述檢測引物組包括一對外引物、一對內引物和一對環引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SPI-F3：5’-TTTACGGTTCCTTTGACGG-3’；

SPI-B3：5’-GCCCCATATTATCCGTATCG-3’；

SPI-FIP：5’-AGTAGACAGGGCGGAGGACTATTGGCGGTATTTCGGTG-3’；

SPI-BIP：5’-ACCATGCTGACCATTGGTGATGCGGCACTAATCGCAATCA-3’；

SPI-LF：5’-AATCCATACCATGGCGAGTC-3’；

SPI-LB：5’-GTCTTGTCGCCCAGATCC-3’。