[發(fā)明專利]可避免假陰性的沙門氏菌恒溫?zé)晒鈾z測引物組、試劑盒及檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510739814.1
• 申請日: 2015-11-02
• 公開（公告）號: CN105219870A
• 公開（公告）日: 2016-01-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹東林;胡亮杉;林茂銳;石磊;周旋;鐘麗梅;方曉琳;陳洵;唐大運(yùn);張璜;申洪杰;雷達(dá);張知洪;田軍章
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省第二人民醫(yī)院;廣州迪澳生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/68
• 分類號: C12Q1/68;C12Q1/04;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 廣州市深研專利事務(wù)所 44229
• 代理人: 姜若天

1.用于檢測沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測引物組合物，其包含一組檢測引物和一組內(nèi)標(biāo)引物，其中，所述檢測引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SPI-F3：5’-TTTACGGTTCCTTTGACGG-3’；

SPI-B3：5’-GCCCCATATTATCCGTATCG-3’；

SPI-FIP：5’-AGTAGACAGGGCGGAGGACTATTGGCGGTATTTCGGTG-3’；

SPI-BIP：5’-ACCATGCTGACCATTGGTGATGCGGCACTAATCGCAATCA-3’；

SPI-LF：5’-AATCCATACCATGGCGAGTC-3’；

SPI-LB：5’-GTCTTGTCGCCCAGATCC-3’；

所述內(nèi)標(biāo)引物組包括一對外引物、一對內(nèi)引物和一對環(huán)引物，其核苷酸序列分別如下所示：

SPF-F3：5’-TGAGTGGCGGTACTATTCA-3’；

SPF-B3：5’-GTGTTATCTGCCTGACCAG-3’；

SPF-FIP：5’-GCCGTAAAGCTGGCGGTACACTAAATCCGCCGATCAA-3’；

SPF-BIP：5’-GATTGGTGATACGACCGCACATTTCGGATCGCAGTCATTC-3’；

SPF-LoopF：5’-TATTGACCCAACGTCACCG-3’；

SPF-LoopB：5’-TGCCTTTCACCATCGTCC-3’。

2.一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，檢測試劑盒包括權(quán)利要求1所述的檢測引物組和內(nèi)標(biāo)引物組。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，所述檢測引物組及內(nèi)標(biāo)引物組中，外引物、內(nèi)引物、環(huán)引物的摩爾比為：1-2：4-8：2-4。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，包括以下成分：（1）DNA聚合酶；（2）反應(yīng)液；（3）內(nèi)標(biāo)靶標(biāo)片段；（4）陽性對照和陰性對照。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，所述DNA聚合酶為BstDNA聚合酶。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，所述恒溫?zé)晒夥磻?yīng)液含有：10mMdNTP、10×ThermoPol反應(yīng)緩沖液、160mMMgSO₄水溶液、三者的體積比是7：4：3。

7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測試劑盒，其特征在于，陽性對照為含有沙門氏菌SPI基因片段的T載體克隆，陰性對照為超純水，內(nèi)標(biāo)靶標(biāo)片段為含有沙門氏菌SPJ基因片段的T載體克隆。

8.一種沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測方法，包括如下步驟：

（1）提取待檢樣品DNA；

（2）利用權(quán)利要求1的恒溫?zé)晒庖锝M合物對待檢樣品DNA進(jìn)行恒溫擴(kuò)增；

（3）結(jié)果判斷：將反應(yīng)管中置于恒溫?zé)晒鈾z測儀或熒光PCR儀中，實(shí)時讀取熒光信號，根據(jù)SPI基因檢測結(jié)果和內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果進(jìn)行判斷：

SPI基因檢測結(jié)果為陽性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陽性時，檢測結(jié)果為陽性；

SPI基因檢測結(jié)果為陰性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陽性時，檢測結(jié)果為陰性；

SPI基因檢測結(jié)果為陽性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陰性時，檢測結(jié)果為陽性；

SPI基因檢測結(jié)果為陰性內(nèi)標(biāo)基因SPF檢測結(jié)果全為陰性時，檢測結(jié)果可能為假陰性，建議重新提取DNA進(jìn)行檢測。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測方法，其特征在于，恒溫擴(kuò)增的25μl反應(yīng)體系含有：SPI-F30.2μM，SPI-B30.2μM，SPI-FIP1.6μM，SPI-BIP1.6μM，SPI-LF0.8μM，SPI-LB0.8μM，SPF-F30.2μM，SPF-B30.2μM，SPF-FIP1.6μM，SPF-BIP1.6μM，SPF-LoopF0.8μM，SPF-LoopB0.8μM，反應(yīng)液12.5μl，DNA聚合酶8U，10×SYBRGreenI0.5μl，待檢樣品2μl，內(nèi)標(biāo)2μl，用超純水補(bǔ)齊到25μl。

10.根據(jù)權(quán)利要求8所述的沙門氏菌的恒溫?zé)晒鈾z測方法，其特征在于，恒溫擴(kuò)增的程序?yàn)椋?3～65℃反應(yīng)30～45min，并在80℃持續(xù)2min。