[發(fā)明專利]小分子量透明質(zhì)酸的制備方法與應(yīng)用及透明質(zhì)酸裂解酶基因載體和工程菌

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201510734368.5
• 申請日: 2015-11-02
• 公開（公告）號: CN105274127A
• 公開（公告）日: 2016-01-27
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 劉浩;張海洋
• 申請（專利權(quán)）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N1/21;C12N9/88;C12P19/26;C12P19/14;C12R1/19
• 代理公司: 天津諾德知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 12213
• 代理人: 欒志超

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及透明質(zhì)酸生產(chǎn)領(lǐng)域，更具體地說涉及一種小分子量透明質(zhì)酸的制備方法與應(yīng)用及透明質(zhì)酸裂解酶基因載體和工程菌。

背景技術(shù)

透明質(zhì)酸(HA)又名玻尿酸，是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰葡糖胺雙糖單位以β-1,3糖苷鍵和β-1,4糖苷鍵交替連接而成的線性高分子酸性粘多糖。HA廣泛分布于機體的組織間質(zhì)中并隨分布部位的的不同而展現(xiàn)出不同的生理作用，如在皮膚中有較好的保水作用，在關(guān)節(jié)滑液中有潤滑和防磨損的作用，并對組織和血管的再生有重要作用，因而透明質(zhì)酸被廣泛應(yīng)用于化妝品、食品保健、美容整形和醫(yī)藥等領(lǐng)域。

近來文獻報道，小分子量的透明質(zhì)酸展現(xiàn)出特有的生物活性。West等發(fā)現(xiàn)4～25個雙糖單位的透明質(zhì)酸寡糖具有促進血管生成的活性，Mr低于10000Da的透明質(zhì)酸對于血管的再生有顯著意義。Kim等將低分子量的透明質(zhì)酸接枝到其他聚合物主鏈上制成聚合物藥物載體，做成溫控釋放型的藥物載體。Brown分別給胸腺癌裸鼠尾靜脈注射含透明質(zhì)酸(Mr為0.825×10⁶)和不含透明質(zhì)酸的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤，發(fā)現(xiàn)含透明質(zhì)酸的5-氟尿嘧啶和甲氨蝶呤明顯增加藥物的療效，主要表現(xiàn)在動物體質(zhì)量增加，腫瘤體積明顯減少，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率降低等。

目前，小分子量的透明質(zhì)酸的制備方法主要有物理方法如超聲波降解，化學方法如過氧化氫和次氯酸鈉降解法，和酶法降解如動物睪丸來源的透明質(zhì)酸酶來酶解透明質(zhì)酸，三種方法相比，物理方法需要劇烈的條件，而且很難制備分子量在10KD以下的透明質(zhì)酸寡糖。化學方法對透明質(zhì)酸結(jié)構(gòu)的破壞程度較大，而且生產(chǎn)過程容易對環(huán)境造成污染，而酶法制備小分子量透明質(zhì)酸條件較溫和，反應(yīng)容易控制，但動物組織來源的的透明質(zhì)酸裂解酶數(shù)量有限，不利于工業(yè)化生產(chǎn)。因此，利用生物工程技術(shù)克隆和表達微生物來源的透明質(zhì)酸裂解酶基因?qū)τ谛》肿恿客该髻|(zhì)酸的工業(yè)化生產(chǎn)具有重要意義。

關(guān)于對微生物來源的透明質(zhì)酸酶的研究，其中最深入的是Streptococcuspneumoniaea和Streptococcusagalactiae(groupB)。JedrzejasMJ等對這兩種酶的催化機制做了詳細的闡述，兩種酶均通過β-消除機制降解大分子量的透明質(zhì)酸得到4,5-不飽和雙糖。中國專利(CN103255076A)提供了一種從芽孢桿菌發(fā)酵液中分離純化透明質(zhì)酸裂解酶，并用純化后的酶來制備低分子量的透明質(zhì)酸鹽。中國專利(CN101633931)利用pBV220表達載體表達透明質(zhì)酸裂解酶基因并在42℃條件下誘導(dǎo)，不過得到的產(chǎn)物為包涵體，需要進行蛋白的復(fù)性，不利于大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明克服了現(xiàn)有技術(shù)中的不足，現(xiàn)有的酶法制備小分子量透明質(zhì)酸條件較溫和，反應(yīng)容易控制，但動物組織來源的的透明質(zhì)酸裂解酶數(shù)量有限，不利于工業(yè)化生產(chǎn)，提供了一種小分子量透明質(zhì)酸的制備方法與應(yīng)用及透明質(zhì)酸裂解酶基因載體和工程菌，通過克隆獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920透明質(zhì)酸裂解酶基因hylb片段,并構(gòu)建包含其基因的表達載體，轉(zhuǎn)到宿主菌后并通過宿主菌發(fā)酵獲得酶活力較高的透明質(zhì)酸裂解酶，并用該裂解酶催化大分子量透明質(zhì)酸的降解，通過控制反應(yīng)條件，成功且大量的制備小分子量的透明質(zhì)酸。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案予以實現(xiàn)。

透明質(zhì)酸裂解酶基因載體，所述基因載體將長度為2208bp的hylb基因插入載體pET28a中，形成載體pET28a::hylb。

所述hylb基因來源于獸疫鏈球菌(Streptococcuszooepidemicus)ATCC39920基因組。

所述hylb基因始于第128個氨基酸GCC，結(jié)束于終止密碼子TAG，所述hylb基因序列如序列1所示。

將所述載體pET28a::hylb轉(zhuǎn)入宿主菌，即獲得透明質(zhì)酸裂解酶工程菌。

所述宿主菌為大腸桿菌BL21(DE3)。

所述誘導(dǎo)條件為在20-37℃的條件下，向培養(yǎng)基中加入0-1mMIPTG誘導(dǎo)過夜；優(yōu)選在20℃的條件下，向培養(yǎng)基中加入0.1mMIPTG誘導(dǎo)過夜。

透明質(zhì)酸裂解酶的制備方法為使用所述透明質(zhì)酸裂解酶工程菌發(fā)酵獲得，按照下述步驟進行：

步驟1，將所述透明質(zhì)酸裂解酶工程菌接種到LB培養(yǎng)基上，在37℃的條件下培養(yǎng)，得到菌液；

步驟2，將上述菌液轉(zhuǎn)入離心杯中，4℃離心，收集菌體；

步驟3，將菌體置于預(yù)冷的PBS緩沖液中重懸，得到重懸后的菌體；